管西婷谢希罗晓敏邵枫王玮文

青少年期是从儿童期向成年期转变的阶段，也是个体神经和行为发育的关键阶段［1］。临床流行病学调查表明，有青少年期负性生活事件的人群在成年期罹患精神疾病的比率显著高于正常人群［2］。但迄今为止，青少年期应激通过何种途径或机制对精神疾病的发病产生长期的影响尚未明确。研究表明，自断乳期持续至成年的社会隔离改变大鼠的社会行为、焦虑行为和自发活动性［3］。此外，以成年个体为实验对象，研究证实慢性不确定性应激能够诱导大鼠明显的情绪行为改变［4］。因此，本研究旨在比较特定发育阶段—青少期社会隔离和不确定性应激对大鼠成年后情绪行为的长期影响，筛选和建立青少期应激增加成年大鼠情绪障碍易感性的动物模型，为进一步研究其神经机理提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物和分组 鼠龄24 d(Post natal day，PND24)雄性SD大鼠40只，购自中国军事医学科学院实验动物中心。所有动物在SPF级动物实验室内饲养，控制环境温度(22±1)℃，湿度(50±5%)，12 h明∕暗周期(7:00/19:00)。动物到达实验室3 d后(PND28)开始实验。实验期间除了行为测试和应激处置自由进水饮食饲养。根据研究文献，啮齿类动物出生后28～56 d大致对应于人类的青少年期［1］，因此本研究选择在PND28～41给予青少期大鼠两周应激刺激，包括社会隔离和不确定性应激两个实验。所有实验程序已通过中国科学院心理研究所动物管理和使用委员会审核和批准。

1.2 实验程序

1.2.1 实验一 20只大鼠随机分为社会隔离组和群养组各10只。既往研究表明饲养环境因素显著影响社会隔离的效果，一般来说更为单调的饲养环境产生更为明显的行为和生理改变［5］。本研究采用与我们以往报道相同的社会隔离范式［6］。社会隔离组动物单独饲养于不透明的乳白色塑料盒中(45 cm×30 cm×20 cm)，使得隔离大鼠间无视觉及触觉接触;除了每周一次更换垫料外与工作人员无任何接触，严格控制实验人员和饲养人员进出等以保证社会隔离的效果。其相应对照组为群养组(3～4只/盒)。群养组与隔离应激组同屋放置以保持饲养环境的一致性。在2周社会隔离结束后，社会隔离组恢复群养(3～4只/盒)直至成年。

1.2.2 实验二 20只大鼠随机分为不确定性应激组及对照组各10只。不确定性应激与我们以往研究采用的范式类似［7］。两组大鼠分别置于不同的房间，单笼饲养于不锈钢栅栏笼中，动物之间可以有视觉、听觉和躯体接触。不确定性应激包括多种复合刺激，如食物和水剥夺，倾斜笼子(45度)，持续照明或明暗颠倒，潮湿垫料，变动的配对关系，频闪灯(180次/min)，空瓶刺激(水剥夺后空水瓶刺激1 h)，限制进食(2粒，食物剥夺后3 h给予)，热环境(37℃，30 min)，冷刺激(8℃，30 min)。刺激随机安排于一周内，每日2～5种，共给予两周。对照组动物正常饲养，且隔天抚摸2min保持与应激组类似的操作性接触。青少期应激结束后经3周恢复至所有动物成年后(＞PND 62)检测其情绪行为。

1.3 抑郁样行为检测 ①糖水偏好测试:在PND62－63，经20 h隔夜饮水剥夺后，所有动物进行1 h双瓶测定(一瓶饮用水，一瓶1%蔗糖水溶液)，测量动物饮用水和糖水的摄入量。其中社会隔离组和群养组在检测前4 h在同一房间单笼分养。糖水偏好指数(一种反映快感缺乏程度的指标)为糖水摄入量与总的液体摄入量之比。随后恢复正常摄食和饮水;②强迫游泳测试:在下述焦虑行为测试结束后进行(PND65－66)。第一天前测阶段(PND65)，所有动物在水深30 cm、水温23～24℃的圆形玻璃缸中(直径25 cm，高50 cm)强迫游泳15min，随后将动物拭干并放回笼中。每只动物训练后均更换新水。第二天检测阶段(PND66)，再次将动物放入水中强迫游泳5 min，并摄像。随后定义每5 s间隔内如下行为:不动/漂浮行为，挣扎/攀爬行为和游动行为。由不明确本实验分组者统计上述行为出现次数。

1.4 焦虑样行为检测 ①旷场测试:在PND64，将动物置于高50 cm、直径180 cm的圆形旷场中。记录大鼠在旷场内5 min的行为表现，包括水平活动距离和直立次数。其中水平活动距离通过行为跟踪分析系统自动获取，直立次数直接观察记录并通过录像校验。②高架十字迷宫测试:在旷场测试后进行。装置高50 cm，开放臂为110 cm×10 cm×10 cm(长 ×高 ×宽)，闭合臂为110 cm×10 cm×10 cm(长×高×宽)。每次测试都将大鼠面向开放臂置于迷宫中央区。测试时间为5 min，通过计算机监测系统自动记录开放臂进入次数和停留时间，闭合臂进入次数和停留时间。

1.5 统计方法采用SPSS 13.0处理实验数据。所有数值以均值±标准误(M±SE)表示。采用独立样本t检验比较社会隔离组与群养组、不确定性应激组与对照组的组间差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 青少期社会隔离对大鼠成年后抑郁样行为的影响 与群养组相比，青少期社会隔离组大鼠成年后的糖水偏好指数(t=1.60，P＞0.05)、强迫游泳测试中的攀爬行为((t=－0.40，P＞0.05)、游动行为(t=0.63，P＞0.05)和不动行为(t=0.20，P＞0.05)均无差异。见表1。

2.2 青少期社会隔离对大鼠成年后焦虑样行为的影响 与群养组相比较，青少期社会隔离组大鼠成年后在旷场测试中的水平运动距离和直立次数无明显差异(t=0.47，P＞0.05;t= －0.59，P＞0.05)，两组间在高架十字迷宫测试中的闭合臂进入次数(t=－2.09，P＞0.05)和停留时间(t=－0.09，P＞0.05)以及开放臂进入次数(t=－0.53，P＞0.05)和停留时间(t=0.52，P＞0.05)也均无差异。见表1。

2.3 青少期不确定性应激对大鼠成年后抑郁样行为的影响 与对照组相比，经历青少期不确定性应激的研究组大鼠成年后糖水偏好指数没有明显差异(t=－0.05，P＞0.05)，而在强迫游泳测试中不动行为明显增加(t=2.14，P＜0.05)而挣扎行为明显减少(t=－2.36，P＜0.05)。见表2。

2.4 青少期不确定性应激对大鼠成年后焦虑样行为的影响 t与对照组相比，经历青少期不确定性应激的研究组大鼠成年后在高架十字迷宫闭合臂的停留时间明显增加(t=2.29，P＜0.05)而开放臂的进入次数明显减少(t=－2.14，P＜0.05)。见表2。

3 讨论

本研究比较了青少期社会隔离和不确定性应激对大鼠成年后各种情绪行为的长期影响。分别采用糖水偏好测试和强迫游泳测试检测快感缺乏和不可逃避的急性应激情境下无助、绝望行为以反映动物的抑郁水平;采用旷场和高架十字迷宫测试以检测动物的焦虑水平，这些指标都已被证实可以作为评价动物情绪行为的有效指标［8］。

表1 青少期社会隔离对大鼠成年后抑郁样行为及焦虑样行为的影响 M±SE

表2 青少期不确定性应激对大鼠成年后抑郁样行为及焦虑样行为的影响 M±SE

研究结果表明，青少期(PND28～41)2周的社会隔离饲养对大鼠成年后各项所检测的抑郁样和焦虑样行为均缺乏明显的作用。以往研究采用的社会隔离应激大多从断乳期(通常在出生后21 d～28 d)持续至成年期(＞出生后56 d)，跨越了儿童期、青少期和成年期多个发育阶段，且通常在社会隔离状态下进行各项指标的检测。因此，无法区分社会隔离诱导的行为和生理改变是由于早期发育阶段社会隔离的长期后果抑或只是当前社会剥夺状态的作用［5］。近年来，一些研究开始探讨特定发育阶段短暂的社会隔离应激对大鼠成年后情绪行为的影响，但研究得到的结果并不一致。例如，有研究发现断乳后(出生后21～28 d)开始的2到3周的社会隔离应激并不影响大鼠成年后旷场自发活动性和/或高架十字迷宫行为［9－10］。与此一致，本研究也发现在青少期早期(PND28～41)经历两周社会隔离并未造成对成年大鼠上述行为的长期影响。也有研究报道，在青少期晚期(PND38～51)经历两周社会隔离的大鼠成年后高架十字迷宫行为没有明显改变，但旷场自发活动水平明显增加(水平运动距离增加)［6］。这些提示社会隔离应激对大鼠情绪行为的影响也可能与应激发生的时间有关。此外，既往研究大多发现从断乳期直至成年(＞4周)的社会隔离对成年大鼠的快感缺乏和强迫游泳诱导的绝望行为等典型抑郁样行为的作用不显著［11－12］。本研究的结果也表明短暂的2周青少期社会隔离应激对成年大鼠的上述行为缺乏明显作用。总之，本研究结果提示，青少期早期(PND28～41)社会隔离对大鼠成年后的焦虑与抑郁样情绪行为缺乏长期影响。

本研究结果显示，经历青少期(PND28～41)不确定性应激的成年大鼠与其对照组相比糖水偏好指数没有明显改变，但在强迫游泳测试中表现出更多的绝望行为(不动行为增加)和更少的主动行为(挣扎行为减少)。尽管以成年个体为实验对象，研究已证实慢性不确定性应激模型具有较好的拟人类抑郁症的表面效度、结构效度和预测效度［4］，但是不确定性应激对青少期大鼠情绪行为的长远影响几无研究涉及。在Pubmed数据库中，仅检索到一项研究报道儿童期至青少期的不确定性应激导致雌性而非雄性大鼠成年后降低的糖水偏好和掩埋行为(一种焦虑行为指标)以及增强的急性应激诱导的神经内分泌反应［13］。与此一致，本研究也发现青少期不确定性应激不影响雄性大鼠成年后糖水偏好行为。但在强迫游泳应激条件下，经历青少期不确定性应激的成年雄性大鼠表现出明显的抑郁样行为，提示青少期不确定性应激并不影响大鼠成年后偏好糖水的本能行为，但导致其应激应对能力受损，对成年应激事件更容易发展出次级的应对无能或无助的抑郁样行为。其他早期应激相关研究也发现，新生期母婴分离应激并不影响成年大鼠的糖水偏好指数［14］。但经历母婴分离应激的成年动物在强迫游泳测试中的不动/漂浮时间明显多于对照组大鼠，也提示经历母婴分离应激的成年大鼠具有行为绝望的高易感性［14－15］。此外，经历青少期不确定性应激的大鼠成年后在高架十字迷宫测试中闭合臂停留时间增加和开放臂进入次数减少，提示该应激同时增加了大鼠成年后的焦虑样行为水平。

综上所述，青少期社会隔离应激和不确定性应激对大鼠成年后情绪行为的影响存在明显差异，青少期不确定性应激能够有效诱导成年大鼠多项情绪行为显著和持续的改变，提供了一种研究青少期应激增加成年大鼠应激性抑郁易感性的动物模型。

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