周亚东 杨 琳 李修斌 汤庆宾 夏作理 史继学

依达拉奉是一种自由基清除剂，其分子结构上具有亲脂基团，易到达脑组织，血脑屏障的通透性高达60%，具有自由基清除和抑制脂质过氧化的作用，可以抑制脑细胞(血管内皮细胞和神经细胞)的过氧化损伤，减轻脑缺血引起的脑水肿和组织损害，是一种有效的脑神经保护剂。自问世以来，已被广泛用于脑梗死的治疗，本实验采用线栓法制备大鼠局灶性大脑中动脉缺血再灌注模型，以探讨依达拉奉对脑缺血时神经细胞凋亡的抑制作用及可能机制。

1 材料

1.1 动物与分组 成年雄性Wistar大鼠36只，体重280～320 g，随机分为假手术(Sham组)组、缺血+生理盐水对照组(NS组)和脑缺血+依达拉奉干预组(依达拉奉组)。每组12只大鼠，6只动物取脑组织用于MDA、SOD活力的检测，6只动物行脑组织病理切片用于免疫组化和TUNEL染色，检测凋亡水平。

1.2 试剂 依达拉奉注射液由先声药业股份有公司提供(30 mg/20 ml);TUNEL试剂盒、caspase-3试剂盒购自北京中杉公司。

1.3 仪器 冰冻切片机显微照相系统超低温冰箱

2 方法

2.1 模型制作 参照Zea-longa法［1］，大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉，颈正中切口，在距颈总动脉(CCA)分叉处约5～8 mm处分别结扎颈外动脉(ECA)和颈总动脉(CCA)，并分离结扎颈内动脉(ICA)的分支翼腭动脉，血管夹阻断ICA的血流，将直径为0.235 cm的尼龙线，肝素浸泡后经CCA上切口(离分叉处约5～8 mm)，进入CCA、ICA，插入深度约为18～20 mm，丝线扎紧CCA，固定尼龙线，依次关闭切口。术中及术后均注意保温。缺血2 h后，拔出尼龙线10 mm恢复灌注，假手术组仅结扎颈总、颈外动脉。依达拉奉治疗组于术前7 d至术后2 d给予依达拉奉(应用生理盐水稀释成浓度1 mg/ml，剂量3 mg/kg)腹腔注入，2次/d。生理盐水组每日两次腹腔注射同等剂量的生理盐水，假手术组不注射药物。

2.2 标本采集 每组取6只动物于术后48 h用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，剪开胸腔，暴露出心脏，经左心室插管，以生理盐水向左心室灌注，至右心房流出的冲洗液转清后，改灌4%多聚甲醛至躯干僵硬时，立即断头取脑，于4%多聚甲醛缓冲液24 h，然后进行石蜡包埋切片，用于检测Caspase-3表达水平及神经细胞凋亡。每组另6只取缺血侧脑组织放入4℃生理盐水，在冰水浴中用玻璃匀浆器制成100 g/L的脑匀浆，用离心机3000r/min，离心15 min，取上清液用于检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)。

2.3 MDA含量、SOD活力测定 以四己氧基丙烷为MDA标准品，用硫代巴比妥酸法测定荧光强度，绘制标准曲线。取100 g/L脑组织匀浆液100μl在与标准曲线相同条件下反应，以空白管调零，测定样品荧光强度，并根据标准曲线计算脑组织MDA含量。SOD活力测定采用改良的黄嘌呤氧化酶法，按试剂盒说明书操作，在550nm处比色。

2.4 免疫组化、细胞凋亡染色并计数 caspase-3蛋白表达检测采用SP法，抗体及SP试剂盒、DAB试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒均购于北京中杉公司。免疫组化反应图像半定量分析:每大脑个标本于视交叉后相应部位连续切片，每隔5张取1张，共取10张切片。每张切片在40倍物镜下，随机选取10个视野，测定阳性细胞数，计算每组平均值。

3 结果

3.1 MDA含量、SOD活力 生理盐水组及依达拉奉治疗组大鼠脑组织匀浆中MDA含量较假手术组显著增高(P＜0.01)，而SOD活力明显低于假手术组(P＜0.01)，同时依达拉奉治疗组脑组织中MDA含量显著低于生理盐水组(P＜0.05)，而SOD活力显著高于生理盐水组(P＜0.05)，详见表1。

表1 3组动物脑组织中MDA含量、SOD活力、caspase-3免疫反应阳性细胞数和凋亡细胞数的比较(个/400倍)

3.2 免疫组化 术后48 h梗死灶周围脑组织可见caspase-3免疫阳性细胞，假手术组也可见少量caspase-3免疫阳性细胞，生理盐水组caspase-3免疫阳性细胞显著增多，依达拉奉治疗组caspase-3免疫阳性细胞较生理盐水组显著减少(P＜0.05)。

3.3 脑组织切片细胞凋亡数测定 TUNEL染色发现凋亡细胞形态学特征示胞体缩小，染色质凝集，密度增高，呈块状或颗粒状，胞核中棕色颗粒。统计结果显示，假手术组凋亡细胞数(个/40倍物镜视野)显著低于生理盐水组和依达拉奉治疗组(P＜0.01)，依达拉奉治疗组凋亡细胞数(个/40倍物镜视野)显著低于生理盐水组(P＜0.05)。

4 讨论

近年研究证实，氧自由基和活性氧在再灌注损伤中起主要作用。在缺血再灌注损伤过程中氧自由基(OFR)如:超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)等呈爆发性增加［2］，MDA 是脂质过氧化的重要终产物之一，反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度;SOD是机体抗氧化损伤防御体系中最重要的抗氧化酶之一，反映了机体清除氧自由基的能力;正常情况下机体内自由基的产生和清除保持着动态平衡，体内SOD活性、MDA含量的变化可以反映机体清除自由基和抗氧化损伤的能力［3］。缺血再灌注时产生的氧自由基可导致脂质过氧化，损伤生物膜(因含脂质双分子结构)引发脂质过氧化反应从而改变它们的功能，细胞膜通透性增强，线粒体肿胀破裂并诱发细胞凋亡［4］;神经细胞凋亡是脑缺血/再灌注损伤的重要环节，是脑缺血再灌注后迟发性神经细胞死亡(delayed neuronal death，DND)的主要形式［5］，因此如果能阻止凋亡的发展，就有可能减轻脑缺血时脑损伤程度，缩小梗死范围。现已明确，细胞凋亡的发生是由基因调控的过程，目前认为细胞凋亡是细胞在各种死亡信号刺激后发生的一系列级联激活的主动性细胞死亡过程。caspase家族在诱导细胞凋亡的分子机制中起着关键作用，是多条凋亡通路的汇聚点，是执行凋亡的最终途径。其中caspase-3被认为是凋亡的关键蛋白酶，一旦被激活，即发生下游的级联反应，使凋亡不可避免，正常情况下，胞质中的caspase-3以无活性的酶原形存在，细胞凋亡信号的出现可导致caspase-3在多种蛋白水解酶的作用下，发生裂解而活化。通过酶解灭活凋亡抑制物、酶解细胞外基质及骨架蛋白、裂解DNA修复相关分子等使细胞解体。因此如能有效抑制caspase-3的活性则可减缓细胞的凋亡。

依达拉奉是一种自由基清除剂，具有自由基清除和抑制脂质过氧化的作用，可以抑制脑细胞(血管内皮细胞和神经细胞)的过氧化作用，本研究旨在探讨依达拉奉对大鼠缺血再灌注损伤后细胞凋亡的抑制作用及其机制，结果发现，脑缺血再灌注后大鼠脑组织MDA含量比假手术组显著升高，SOD活力显著下降，应用依达拉奉治疗后，依达拉奉组比生理盐水组MDA含量明显减少，SOD活性明显回升，这说明依达拉奉有明显抗脂质过氧化及清除自由基的作用，与文献报道相符［6］，依达拉奉治疗组神经元凋亡数比生理盐水组显著下降，同时依达拉奉治疗组的caspase-3表达水平比生理盐水组显著下降，这说明依达拉奉能明显抗脂质过氧化并能有效对抗神经元凋亡。

［1］ Longa EZ，Weinstein PK，carison S，et al Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rat.Stroke，1994，265:1883-1889．

［2］ Jain KK.Neuroprotection in cerebrovascular disease.Expert Opin Investig Drugs，2000，9(4):695-711．

［3］ Palmeira CM，Moreno AJ，Madeira VM.Thiol metabolismis altered by t he herbicides paraquat，dinose band 2，4-D:A study in isolated hepatocytes.Toxicol Lett，1995，81:115-123．

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［5］ Sen S.Programmed cell death:concept，mechanism and control.J Bio l Revcamb Philos Soc，1992，67:287-319．

［6］ Tomatsuri N，Yoshida N，Takagi T，et al.Edaravone，a newly developed radical scavenger，protects against ischemia-reperfusion injury of the small intestine in rats.Int J Mol Med，2004，13(1):105-109.