苗玉和，刘 岩，闫艳丽，郭 宇，舒秀伟

(辽宁益康生物股份有限公司，辽宁辽阳 111000)

仔猪腹泻是影响养猪业发展的主要疾病之一，以往大多采用抗生素治疗，由此导致的耐药性菌株的出现、动物肠道微生态平衡的破坏、畜禽产品药物残留等严重问题，已经威胁到人类和动物的健康。研制无毒副作用、无残留、无污染的微生态制剂，已成为必然的发展趋势。目前，应用于微生态制剂的菌种主要有乳酸杆菌、链球菌、双歧杆菌、某些芽孢杆菌、酵母菌等。乳酸杆菌是仔猪肠道正常微生物区系中的优势菌群，可利用糖类发酵产生大量乳酸，有的还产生乙酸及其他挥发性脂肪酸，对致病菌具有很好的抑制作用，对维持仔猪肠道微生物区系平衡和消化机能起着重要作用［1－7］。目前，已有众多学者报道利用乳酸杆菌制成的微生态制剂，替代抗生素预防和治疗畜禽消化道疾病［8－9］。本研究拟从健康仔猪肠道中分离筛选出抗逆性乳酸杆菌，用来研制高效、专一的乳酸杆菌猪用微生态制剂。

1 材料与方法

1.1 材料 在辽阳市某猪场，选定12～60日龄健康仔猪，截取肠道，冷藏并迅速送实验室进行细菌分离。

1.2 菌株 猪源致病性大肠杆菌 C83902株(CVCC196)、仔猪副伤寒沙门氏菌 C500株(CVCC79500)、金黄色葡萄球菌(CVCC1882)均购自中国兽医药品监察所。

1.3 培养基 MRS培养基［1］。

1.4 主要试剂 各种糖发酵管购自杭州天和微生物试剂有限公司;基因组提取试剂盒、Ex－taq、dNTP等PCR试剂等购自宝生物(大连)有限公司;其余均为分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 乳酸杆菌的分离鉴定 参照文献［1，3］方法进行。

1.2.2 抑菌试验 采用牛津杯法［8］，测定5株乳酸杆菌对猪源致病性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌能力。

1.2.3 生长曲线的测定 将分离菌株活化后以2%(V/V)的接种量接入MRS液体培养基，37℃培养，每隔2 h取样至30 h，测定 OD600值，绘制生长曲线。

1.2.4 耐酸试验 将抑菌试验筛选出的菌株活化后，按 2%接种量接种于 pH 值为 1.5、2.5、3.5、4.5的液体培养基中，37℃培养8 h;用无菌移液管取出1 mL菌液进行梯度稀释，取3个适宜稀释度菌液各0.1 mL，涂布MRS固体培养基，进行平板菌落计数，并计算菌株存活率［11］。

1.2.5 耐胆盐试验 将抑菌试验筛选出的菌株活化后，按2%的接种量接种于胆盐浓度为(W/V)0.1%、0.2%、0.3%、0.4% 液体培养基中，37 ℃ 培养16 h，平板计数法进行菌落计数，并计算菌株的存活率［12］。

1.2.6 耐胰酶试验 将抑菌试验筛选出的菌株活化后，按2%的接种量分别接种于含有胰蛋白酶的液体培养基中，胰蛋白酶的浓度分别为(W/V)0.8%、1.0%、1.2%、1.4%，37 ℃培养16 h，平板计数法进行菌落计数，并计算菌株的存活率［11］。

1.2.7 PCR鉴定 对上述试验筛选出的抗逆性较强的约氏乳杆菌进行PCR鉴定。根据Genbank上登录的约氏乳杆菌16S rDNA序列设计一对特异性引物:P1(上游):5’－TGGGCGTCTATAATGCAG －3’;P2(下游):5’－CTCTGTCTACTTAGACGG －3’，引物由宝生物(大连)有限公司合成。以提取的细菌基因组DNA为模板，进行目的片段的扩增。反应参数为:95℃预变性5 min;94℃变性50 s、54℃退火1 min、72℃延伸1 min，30个循环后72℃延伸10 min。反应结束后，取5 μL产物用1%琼脂糖凝胶电泳观察。

2 结果

2.1 细菌分离鉴定 本试验共分离到5株革兰氏阳性无芽孢杆菌，编号分别为 LY1、LY7、LY11、LY16、LY25。根据革兰氏染色及生化鉴定结果，对照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定方法》，初步鉴定为 LY1为罗伊氏乳杆菌;LY7、LY16为约氏乳杆菌;LY11为嗜酸乳杆菌;LY25为植物乳杆菌。

2.2 抑菌试验结果 结果见表1。5株乳酸杆菌对3株猪源致病菌均有一定的抑制能力。其中，LY7、LY11、LY25菌株对大肠杆菌、沙门氏菌的抑菌能力较强，且LY7最强;LY11、LY25对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较好，LY7对金黄色葡萄球菌的抑菌能力虽不及LY11、LY25，但也明显强于LY1、LY16。LY1、LY164菌株对3种致病菌的抑菌能力均相对较差。综合试验结果，选择 LY7、LY11、LY25菌株进行后续试验。

表1 乳酸菌抑菌圈直径测定结果 mm

2.3 生长曲线测定 图1结果表明，LY7、LY11、LY25菌株在液体MRS培养基中，起初0～4 h处于延滞期，而LY25菌株延滞期较长，为0～6 h;LY7、LY11在4～8 h进入对数生长期，而LY25在6～12 h进入对数生长期;LY7在14 h的OD600达到最高并开始进入稳定期，而LY11在12 h OD600达到最高并开始进入稳定期，LY25在16 h OD600达到最高并开始进入稳定期。

图1 3株乳酸杆菌生长曲线

2.4 耐酸试验 由图2可知，LY7、LY11在pH2.5条件下，培养8 h 后仍有较高存活率，pH3.5、pH4.5对菌株生长无抑制;而LY25对低pH耐受力较差。

图2 不同pH值条件下乳酸杆菌的存活率

2.5 耐胆盐试验 结果见表2。LY7对高浓度胆盐有很强的耐受能力，在0.3%胆盐浓度下，培养16 h，存活率仍能达到55%;而LY11、LY25对胆盐耐受能力很差，特别是LY25，基本对胆盐无耐受能力。

2.6 耐胰酶试验 由图3可知，LY7对胰酶有一定的耐受能力，在1.2%胰酶浓度下作用16 h，存活率可达65%，而LY11、LY25对胰酶耐受能力较差。

表2 不同胆盐浓度下的乳酸杆菌存活率

图3 不同胰酶浓度下的乳酸杆菌存活率

2.7 PCR鉴定结果 电泳检测显示(图4)，扩增到约1 500 bp的目的条带。PCR产物经纯化后测序，扩增到的目的片段大小为1 467 bp，对照NCBI上发表的约氏乳杆菌16S rDNA序列，进行同源性分析，与AB295648、FJ557011等菌株同源性为99.1%，进一步从分子水平证实该菌株为约氏乳杆菌。

图4 PCR鉴定结果

3 讨论

3.1 目前，市售的微生态制剂菌种绝大部分来自土壤、水等环境，与动物体内环境存在着较大差异，真正应用于动物时，使用效果将大打折扣。本试验分离得到的5株乳酸杆菌均来自健康仔猪肠道，理论上讲，能够很好的适应仔猪肠道环境。

3.2 我们首先经抑菌试验，初步筛选出3株(LY7、LY11、LY25)抑菌能力较强的菌株进行下一步试验。而乳酸菌制剂经口服方式饲喂动物，须能够耐受胃内低pH的环境。本实验选育的LY7、LY11菌株在 pH2.5，8 h 后存活率仍有 78.33%、81.44%，pH3.5、4.5对菌株生长无抑制。而 LY25菌株在pH2.5，8 h后存活率仅为6.73%。仔猪出生时胃内pH值在5～6之间，因高产酸细菌定植而逐渐下降，数小时后pH值即降至4左右，2月龄前pH值保持在3左右，成年猪的最低pH值可达到1.5［12］。因此，LY7、LY11菌株相对LY25菌株更有可能通过猪的胃进人肠道。

3.3 作为口服制剂，还需具备耐受小肠中胆盐等形成的高渗透压环境的能力。0.1%和0.2%胆盐对LY7菌株生长没有影响，在胆盐浓度升至0.3%以后，LY7菌株在16 h时存活率仍能达到55%，而LY11、LY25菌株对胆盐的耐受性较差。对哺乳仔猪而言，其胆囊内胆汁量很少，在出生后3周内胆汁量增加缓慢，一般在0.03% ～0.3%范围内波动［13－14］。所以LY7菌株在肠道的存活机会很大。

3.4 本实验同时对 LY7、Y11、LY25菌株的耐胰酶能力进行了测定，结果表明，LY7菌株可耐受1.0%的胰酶，而 LY11、LY25菌株对胰酶的耐受性较差。

3.5 综合上述试验结果，约氏乳杆菌LY7株可以作为研制猪用微生态制剂的候选菌株，我们将开展进一步的试验研究。

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