江 刚，戴爱国

(1.湖南省人民医院呼吸内科，长沙 410005;2.湖南省老年医院-湖南省老年医学研究所呼吸疾病研究室，长沙 410016)

氧化/抗氧化失衡是慢性阻塞性肺疾患(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的主要发病机制之一，香烟烟雾是引起COPD进展的危险因素。核因子相关因子 2(nuclear factor-E2 related factor，Nrf2)是调节抗氧化基因和维持细胞内氧化还原稳态的关键转录因子。谷胱甘肽(glutathione，GSH)是肺内主要的抗氧化剂，GSH及其合成限速酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS)在COPD的抗氧化机制中具有重要作用。研究表明不典型蛋白激酶C(antypical protein kinase C，aPKC)、磷酯酰肌醇-3-激酶 (phosphoinositol-3-kinase，PI3K)信号通路参与Nrf2激活及对抗氧化基因的调节[1]。本研究通过香烟烟雾提取物诱导大鼠气道上皮细胞氧化应激，使用PI3K 和aPKCι/ζ抑制剂进行干预，探讨PI3K/Akt-aPKCι/ζ-Nrf2 信号通路在大鼠气道上皮细胞抗氧化机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 白沙牌香烟(湖南白沙卷烟厂)、RTPCR(日本Toyobo公司)、RO318220和Nrf2多克隆抗体(美国 Santa Cruz公司)、LY294002 和 p-aPKCι/ζ抗体(美国Cell Signaling公司)、PIERCE蛋白提取液(美国Pierce公司)、异硫氰酸(FITC)-藕联的抗大鼠抗体和抗兔抗体(北京中杉金桥)、γ-GCS多克隆抗体和细胞角蛋白18单克隆抗体(武汉博士德生物公司)。

1.1.2 实验动物 雄性清洁级SD大鼠30只，体质量180～200g，由中南大学湘雅医院动物实验部提供。

1.2 实验细胞来源及分组

1.2.1 大鼠气道上皮细胞原代培养 参照Wu等方法培养SD大鼠气道上皮细胞，待细胞 70%～80%融合时，采用电镜和细胞角蛋白18免疫荧光方法鉴定及分别取1×106个细胞用于实验，每次实验重复5次[2]。

1.2.2 分组 将30只SD大鼠随机分为对照组和CSE(cigarette smoke extract，CSE)处理组，每组 5 只 。CSE处理组为将气道上皮细胞与含10%CSE和……