李英利，常继涛，于 力

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物病研究室，黑龙江 哈尔滨 150001)

牛肠道病毒(Bovine enterovirus，BEV)是小RNA病毒科肠道病毒属的成员。病毒粒子呈球形，二十面体，无囊膜，完整病毒粒子直径约为25 nm～30 nm。病毒基因组为不分节段的单股正链RNA，全长约为7.5 kb，可直接作为mRNA翻译出一个多聚蛋白，经过一系列降解，产生4种结构蛋白(VP1、VP2、VP3和 VP4)和 7种非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C 和 3D)[1]。1959年 Moll和Davis首次分离到BEV[2]，随后其他国家也相续有BEV的分离报道[3-5]。1988年Earle等首次发表了BEV的全基因组序列[6]，目前在GenBank登录的全基因组序列有12条。1993年，Smyth等获得了BEV粒子的晶体，并且展示了它的三维立体形态[7]。BEV对酸碱和温度具有较强的耐受能力。Sedmak等发现BEV是小鼠许多肿瘤疾病的融瘤因子[8]。因此，BEV在肿瘤疾病的防制和病毒载体的开发上具有潜在的应用价值。本研究从采自我国部分地区奶牛场的牛粪便拭子样品中分离出一株BEV，该病毒的分离在国内尚属首次。

1 材料和方法

1.1 病料及实验材料 牛粪便样品系2008年采自内蒙古某奶牛场，-70℃冻存；MA104细胞为本研究室保存；培养液为含8%胎牛血清的DMEM。

1.2 主要试剂 PrimeSTAR DNA聚合酶、Primescript反转录酶、Oligo(dT)引物均购自TaKaRa公司；TRIzol购自Gibco BRL公司；DNA胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。

1.3 样品处理 采集的粪便样品，用PBS制成1∶10(W/V)悬液，漩涡振荡器震荡，反复冻融3次，3000 r/min，4℃离心10 min，取上清，用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌后，-70℃冰箱保存备用。

1.4 病毒的分离培养 经处理的粪便样品，接种MA104细胞单层，37℃吸附1 h，加入无血清的DMEM，5%CO237℃培养，每天观察细胞病变(CPE)。……