黄俊华，贺 番，孙 元，张 鑫，常天明，李宏宇，仇华吉

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室，黑龙江 哈尔滨 150001)

T7 RNA聚合酶(RNAP)是T7噬菌体编码的一种依赖于DNA的RNAP，对T7启动子序列具有高度特异性，是分子克隆和反向遗传操作常用的RNAP。T7 RNAP基因能够稳定地整合到哺乳动物细胞的基因组中，并且可以在多种靶细胞内高水平表达[1]。由于T7 RNAP在真核细胞中具有转录活性，广泛应用于病毒拯救[2]。PK-15细胞系是猪瘟病毒(CSFV)等猪源病毒的敏感细胞系，常用于CSFV的分离培养和体外增殖。本研究构建稳定表达T7 RNAP的PK-15细胞系，为CSFV等猪源RNA病毒的反向遗传操作提供有效的方法。

1 材料和方法

1.1 菌株、质粒和细胞 E.coliBL21(DE3)和DH5α均购自Solarbio公司；质粒pLXSN、pET-32a(+)、pDsRed1-N1、PT67细胞和PK-15细胞均由本实验室保存。

1.2 主要试剂 细菌基因组提取试剂盒购自天根公司；pMD18-T、逆转录病毒载体pLXSN、pDsRed1-N1、Platinum®Taq高保真DNA聚合酶和LipfectamineTM2000转染试剂购自Invitrogen公司；质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒和组织DNA提取试剂盒均购自Omega公司；NdeⅠ、BsrGⅠ、ScaⅠ、XhoⅠ、KpnⅠ、BamHⅠ、SmaⅠ和T4 DNA连接酶均购自NEB公司；抗T7 RNAP单克隆抗体(MAb)购自Novagen公司；新霉素(G418)和FITC标记的羊抗鼠IgG均购自Sigma公司。

1.3 T7 RNAP基因的扩增与克隆 按照试剂盒说明书方法提取BL21(DE3)细菌基因组DNA，根据GenBank登录的T7 RNAP基因(M38308)序列，设计一对引物，PT7RNAP-F：5'-GAGCTCGAGCCACCAT GAACACGATTAACATCG-3'；PT7RNAP-R：5'-GAT GGATCCCGTTACGCGAACGCGAAGTCC-3'， (下 划线分别为XhoⅠ、BamHⅠ酶切位点，GCCACC ATGG是为提高在真核细胞中表达的Kozak序列[3])。PCR反应程序为：95℃ 5 min；94℃ 30 s、61℃30 s、68℃ 2.5 min，30个循环；72℃ 10 min。扩增片段经胶回收与pMD18-T载体连接，重组质粒pTS-T7RNAP经NdeⅠ和BsrGⅠ酶切鉴定正确后由Invitrogen公司测序。

1.4 表达T7 RNAP的重组逆转录病毒的构建 以ScaⅠ、XhoⅠ和BamHⅠ依次单酶切pTS-T7RNAP，胶回收约2700 bp的片段，与经XhoⅠ和BamHⅠ酶切并回收的pLXSN载体在T4 DNA连接酶的作用下连接构建pLXSN-T7，SmaⅠ和KpnⅠ酶切鉴定。……