穆亚芳，刘家森，郭东春，李茂中，原冬伟，姜 骞，林 欢，曲连东

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/实验动物研究室，黑龙江 哈尔滨 150001)

兔病毒性出血症(Rabbit viral hemorrhagic disease，RHD)是由RHD病毒(RHDV)引起兔的一种急性、败血性、高度致死性传染病。RHDV属于嵌杯病毒科兔病毒属，为单股正链RNA病毒，其基因组中含有两个开放阅读框(ORF)[1]。VP60蛋白由ORF1编码，为RHDV的主要结构蛋白，在诱导抗病毒感染免疫反应中起重要作用[2]。

RHDV主要在肝脏中增殖，导致肝坏死和实质脏器发生水肿、淤血和出血等病理变化[3-4]。兔肝脏细胞中存在能够与病毒相互作用的蛋白，并且在介导病毒侵染肝细胞过程中起到重要作用。因此，从兔肝文库中筛选与RHDV衣壳蛋白VP60相互作用的细胞蛋白具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 菌株、细胞系及实验动物 DH5α、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0由本实验室保存；聚苯乙烯(PS)流式细胞管购自BD公司(简称PS管)；纯化可溶性VP60蛋白为本实验室制备[5]；3月龄普通级新西兰大白兔由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

1.2 主要试剂 SfiⅠ酶、T4 DNA连接酶、Ex Taq聚合酶、DNA Marker等均购自TaKaRa公司；组织总RNA抽提试剂盒购自QIAGEN公司；cDNA文库构建及筛选试剂盒(MatchmakerTMLibrary Construction&Screening Kits)、文库扩增 PCR试剂盒(Advantage®2PCR Enzyme System)购自 Clontech公司；组织/细胞DNA小量抽提试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司；质粒小量提取试剂盒购自Omega Bio-Tek公司；FuGENE®HD Transfection Reagent购自Roche公司。

1.3 引物合成 试验中所用引物根据文库扩增PCR试剂盒提供序列进行合成(表1)。引物的合成及测序由Invitrogen公司完成。

1.4 真核表达文库的构建 按照组织总RNA抽提试剂盒操作说明书提取3月龄兔肝组织总RNA，并构建兔肝脏的pEXP-lib真核表达初级文库。……