张在平，马学恩，杨海彦，田 进，孟庆文*

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150001；2.内蒙古农业大学动物科学与医学学院，内蒙古 呼和浩特 010018)

J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup J，ALV-J)是引起禽类以免疫抑制、生长抑制和髓细胞癌变为特征的传染性、致骨髓细胞瘤疾病或成髓性白血病[1]。目前，ALV-J在我国鸡群中已广泛存在。ALV-J除可以导致禽骨髓细胞瘤(ML)、引起感染鸡群死亡外，还引起免疫抑制，这也是绝大数感染鸡群的主要表现形式。ALV-J的感染造成鸡群的生产性能降低，对疫苗的免疫应答水平降低，导致继发感染其它疾病，造成更严重的经济损失。本研究设计并合成靶向ALVpol基因的RNA干扰(RNAi)序列，构建siRNA真核表达重组质粒，为应用靶向pol基因RNAi抵抗ALV复制的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 病毒株与细胞系 ALV-J山东分离株(SD株)由哈尔滨兽医研究所国家重点实验室保存；DF-1细胞系由哈尔滨兽医研究所步志高研究员提供[2]。

1.2 主要试剂 线性化pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体、E.coliTop10、Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；连接酶、反转录酶购自TaKaRa公司；荧光定量PCR试剂盒购自杭州博日公司；质粒提取试剂盒、病毒RNA提取剂盒均购自上海华舜生物技术有限公司；抗ALV-J单克隆抗体(MAb)JE9由扬州大学秦爱建教授惠赠[3]；鼠抗鸡GAPDH MAb、FITC标记的山羊抗小鼠IgG、罗丹明标记的山羊抗小鼠IgG/TRITC和辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG均购自中杉金桥公司。

1.3 靶向pol基因siRNA重组质粒的构建与鉴定根据pol基因高度保守序列设计5对shRNA(表1)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。……