张丹鹤，蒋媛媛，许兰菊，杨永珍，邓久虎，苗银萍

(河南农业大学，河南 郑州450002)

志贺氏菌(Shigella)是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，俗称痢疾杆菌.根据O抗原的不同，志贺氏菌属可分为痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)、福氏志贺氏菌(S.flexneri)、鲍氏志贺氏菌(S.boydii)和宋内氏志贺氏菌(S.sonnei)4 个群［1］.近年国内外报道，志贺氏菌除感染人外，还能感染猴、犊牛、奶牛、仔猪、幼犬、鸡、鸭、小鼠、豚鼠、袋鼠等多种动物，严重危害人和动物的健康［2～12］.2004 年许兰菊等［2］首次从自然发病鸡体内分离到鸡源志贺氏菌，根据研究鸡源志贺氏菌在生物学及血清学特性等方面与人志贺氏菌相同.鸡源志贺氏菌可引起鸡的腹泻痢疾、血便，重者引起死亡.剖检可见明显的肠道病变，耐过鸡消瘦和生长发育迟缓.鸡志贺氏菌病是鸡的一种新发传染病，常被误诊为鸡白痢或鸡球虫病等，给该病防治造成很大困难，结果导致了严重的经济损失［2，13］.2009-03 新郑某鸡场的8月龄蛋鸡鸡群发生严重腹泻，本研究针对腹泻病鸡采集典型病料进行病原菌分离鉴定，结果分离到鸡源福氏志贺氏菌，并对其病原特性进行了研究，为该病的确切诊断和有效防治提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 鸡群发病情况及病料来源

2009-03-16新郑某养鸡户前来就诊，该鸡场本批共饲养蛋鸡3 000只，8月龄时鸡群发病.鸡群发病后大部分鸡的采食量和产蛋量下降，并具有严重腹泻拉稀症状，部分鸡只发生死亡.剖检病变可见十二指肠出血性炎症.无菌操作采集病死鸡的十二指肠及其肠内容物，备检.

1.2 试验动物及分组

1日龄罗曼商品代蛋公雏40只，购自郑州牧业工程高等专科学校孵化场.按正常标准饲养管理，隔离观察3 d后鸡只均正常.随机抽取5只雏鸡采血分离血清，经检测鸡白痢鸡伤寒沙门氏菌和志贺氏菌抗体均为阴性.将剩余的35只雏鸡随机分为7个小组，每组5只;分别为空白对照组、质量分数1%葡萄糖肉汤对照组和5个攻毒组.

1.3 培养基与染色液

营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、SS琼脂培养基、三糖铁琼脂培养基、西蒙氏枸橼酸盐琼脂培养基;6种细菌微量生化反应管有葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖、尿素.以上培养基和微量生化管均由杭州天和微生物试剂有限公司生产，均在有效期内按说明书使用.质量分数1%葡萄糖肉汤用营养肉汤培养基按1%比例加入葡萄糖配制成.

革兰氏染色液1套，由河南农业大学牧医工程学院畜禽疫病细菌分子生物学与免疫学实验室配制保存.

1.4 志贺氏菌属诊断血清和鸡源志贺氏菌多价凝集抗原

志贺氏菌属4种多价诊断血清，福氏多价诊断血清，痢疾1型诊断血清，痢疾2型诊断血清，宋内Ⅰ相诊断血清(史密氏)，鲍氏多价(1-5型)诊断血清，均由宁波天润生物药业有限公司生产，且在有效期内.鸡源志贺氏菌多价凝集抗原由河南农业大学牧医工程学院畜禽疫病细菌分子生物学与免疫学实验室研制保存.

1.5 药敏纸片

药敏纸片共12种，分别为阿莫西林(AMX，10 μg·片-1)、氨苄/舒巴坦(AM/SU，10/10 μg·片-1)、头孢曲松(CRO，30 μg·片-1)、头孢唑啉(CZ，30 μg·片-1)、罗红霉素(ROX，15 μg·片-1)、庆大霉素(GM，10 μg·片-1)、阿米卡星(AN，30 μg·片-1)、米诺环素(MNO，30 μg·片-1)、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶(STX，23.75/1.25 μg·片-1)、环丙沙星(CIP，5 μg·片-1)、诺氟沙星(NOR，10 μg·片-1)、氧氟沙星(OFL，5 μg·片-1)，均由北京天坛药物生物技术开发公司生产，且在有效期内.

1.6 细菌分离培养及抹片染色镜检

首先将采集病料分别接种于质量分数1%葡萄糖肉汤，置37℃18～24 h增菌培养.然后将增菌培养物分别划线接种于SS琼脂平板及麦康凯琼脂平板，置37℃培养24 h，观察菌落培养性状.

对上述细菌分离培养呈现的典型菌落进行细菌抹片、革兰氏染色和显微镜油镜观察.

1.7 细菌生化试验

挑取SS琼脂平板及麦康凯琼脂平板上的典型菌落接种于质量分数1%的葡萄糖肉汤进行纯化培养18 h，然后将纯化培养菌液分别接种葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖、尿素细菌微量生化反应管，用穿刺法接种三糖铁琼脂斜面和西蒙氏枸橼酸盐琼脂斜面，37℃培养，连续观察7 d，每24 h观察并记录1次结果.MR试验、V-P试验、吲哚试验和明胶液化试验均按照文献［14］进行.

1.8 细菌动物攻毒试验

将鸡源志贺氏菌分离菌株分别接种于质量分数1%葡萄糖肉汤，37℃培养24 h，然后进行菌落计数，每毫升约含菌22.08×108个.采用腹腔注射的方法对3日龄雏鸡进行攻毒，攻毒组注射不同菌株的肉汤培养物0.2 mL·只-1，肉汤对照组腹腔注射灭菌质量分数1%葡萄糖肉汤0.2 mL·只-1，空白对照组不做任何处理.攻毒组和对照组分别进行隔离饲养，每2 h观察并记录雏鸡的表现，对病死鸡及时进行剖检，7 d后对攻毒的存活鸡全部剖检，观察记录剖检病变，采集病料，进行细菌回收试验.

1.9 细菌血清学鉴定

1.9.1 抗原制备 将初步判定的鸡源志贺氏菌分离株接种营养琼脂平板，37℃培养24 h后，将细菌用少量体积分数0.5%的石炭酸生理盐水(pH值为7.2)洗下，制成菌悬液，然后经121～126℃高压灭活2 h破坏细菌的K抗原.用麦氏比浊管进行比浊，调整抗原的最终浓度为40×108个·mL-1，按6%的比例加入碱性美兰染液混匀，置4℃冰箱保存备用.

1.9.2 平板凝集试验 取制备好的细菌抗原50 uL于白瓷板孔中，再加入等量的志贺氏菌属诊断血清，轻摇混匀后，同时设标准阳性、阴性对照以及抗原对照，3～5 min后观察结果.结果判定方法参照文献［14］.

1.10 细菌药敏试验

采用纸片扩散法，检测5个鸡源志贺氏菌分离株对阿莫西林等12种药物的敏感性.试验方法参照文献［16］进行，结果判定标准按产品说明书.

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养结果

将增菌液在SS琼脂和麦康凯琼脂培养基上划线接种，37℃培养24 h后，均可见圆形、微凸、边缘整齐、无色、半透明、直径1～2 mm的小菌落，未见到其它形态的菌落.

2.2 细菌形态及染色特性

对分离的菌落进行细菌抹片、革兰氏染色和镜检.结果均为革兰氏阴性短小杆菌.

2.3 细菌生化试验结果

结果见表1.其中1号、2号和5号菌株分离自十二指肠，3号和4号菌株分离自十二指肠肠内容物.根据试验结果，初步判定5株分离菌均为鸡源志贺氏菌.

表1 5个分离菌株的生化试验结果Table1 Biochemical test results of five isolations

2.4 细菌动物攻毒试验结果

攻毒后，部分鸡出现腹泻拉稀、血便症状，重者死亡.剖检可见鸡的肠道出血性炎症、肝脏肿大等病变.经病原菌分离均可回收到攻毒菌.试验结果见表2，菌株编号同生化试验.

表2 5株鸡源志贺氏菌攻毒试验结果Table2 Challenge experiment results of five strains of shigella isolated from chicken

2.5 细菌血清学鉴定结果

对初步判定的5株鸡源志贺氏菌，用志贺氏菌属诊断血清进行平板凝集试验.经鉴定5个分离菌株均为鸡源福氏志贺氏菌.结果见表3.

2.6 细菌药敏试验结果

由表4可见，这5株鸡源福氏志贺氏菌对阿莫西林、头孢唑林、头孢曲松、庆大霉素、磺胺甲噁唑、环丙沙星、诺氟沙星和氧氟沙星这8种药物都表现出耐药性.1号菌株对12种药物均耐药;2号菌株对阿米卡星敏感，对其它药物耐药;3号菌株对氨苄/舒巴坦、阿米卡星和米诺环素敏感，对罗红霉素的敏感性为中介;4号菌株对氨苄/舒巴坦和阿米卡星的敏感性为中介，对其它药物耐药;5号菌株对氨苄/舒巴坦敏感，对阿米卡星和米诺环素的敏感性为中介，对其它药物耐药.

表3 5株鸡源志贺氏菌的血清学试验结果Table3 Serologic test results of five strains of shigella isolated from chicken

表4 5株鸡源志贺氏菌的药敏试验结果Table4 Drug sensitive test results of five strains of shigella isolated from chicken

3 小结与讨论

本研究经细菌分离鉴定对新郑发生严重腹泻的病鸡群进行了病原诊断，分离出5株鸡源福氏志贺氏菌，且动物攻毒试验表明分离菌株具有明显的致病性.因此，该鸡群发生腹泻病是由鸡源福氏志贺氏菌所引起.药敏试验结果显示，5个分离菌株对阿莫西林等12种药物具有多重耐药性，其中4个菌株对阿米卡星和氨苄/舒巴坦较敏感.

许兰菊等［15］利用研制的鸡源志贺氏菌平板凝集抗原及平板凝集试验，对中国河南、山东等不同地区鸡志贺氏菌病的发病率、流行地区、品种、日龄及其混合感染等进行了血清流行病学调查.结果表明:中国部分地区存在有鸡源志贺氏菌感染，其血清抗体阳性率较高，达28.13% ～33.17%，已远远超过鸡白痢鸡伤寒(1.4%).本研究从腹泻病鸡中分离出鸡源福氏志贺氏菌，进一步说明鸡志贺氏菌病在河南省部分地区呈流行趋势，且存在鸡源志贺氏菌种和型的差异.

本试验分离的5株鸡源志贺氏菌，虽然其生化特性与医学有关文献报道的志贺氏菌属特性不是完全符合，但分离菌株经血清学鉴定均为鸡源福氏志贺氏菌.细菌菌属的生化特性标准是相对于大多数菌株，细菌菌属的各项生化特性指标在不同的菌株间存在有一定的(0% ～10%)差异［16］.菌株的生化特性可以作为细菌鉴定中判定属和种的参考依据，但不能作为判定细菌属和种的唯一标准.志贺氏菌各型之间的生化特性会有一定的差别，志贺氏菌亚群一般通过其生化特性的差异来区分，且常和血清学方法结合起来进行鉴定［17］.因此，本研究除细菌生化试验外，又进行了血清学特异性试验等.因此，本研究细菌鉴定结果是可靠的.由于本次试验所用血清的种类有限，未能将分离菌株鉴定到型及亚型，有待今后进一步研究.

动物攻毒试验结果表明，分离的5个鸡源志贺氏菌菌株可使攻毒鸡发生腹泻和死亡.这进一步说明分离的鸡源志贺氏菌菌株对鸡具有一定的毒力和致病性.一旦鸡群发生志贺氏菌病得不到有效治疗，就会给养殖户带来很大的经济损失.因此，找出防治鸡志贺氏菌病的有效药物显得尤其重要.从药敏试验结果来看，5株鸡源福氏志贺氏菌对阿莫西林等8种药物都表现出耐药性.1号菌株对12种药物均产生了耐药性，其余菌株对氨苄/舒巴坦、阿米卡星和米诺环素的敏感性存在一定的差异.本次试验分离菌株具有多重耐药性，这可能与该地区养殖水平和用药习惯、兽药质量问题及饲料中长期添加某些抗菌类药物等因素有关［18］.因此，建议临床治疗要合理用药，选择敏感药物进行治疗，避免盲目性，尽量减少不必要的经济损失.

［1］ 陆德源.医学微生物学［M］.第5版.北京:人民卫生出版社，2001:119-120.

［2］ 许兰菊，王川庆，胡攻政，等.鸡志贺氏菌在我国的发现及其病原特性研究［J］.中国预防兽医学报，2004，26(4):281-286.

［3］ 韦 毅，佟 飞，刘自民.广西食蟹猴群中志贺氏菌的检出、分型以及对抗菌药物的敏感试验［J］.实验动物科学与管理，1999，16(4):6-9.

［4］ MAURELLI A T，ROUTH PR，DILLMAN R C，et al.Shigella infection as observed in the experimentall inoculated pig［J］.Susscrofa Domestica Microb Pathog，1998，25(4):189-196.

［5］ ALABOUDI A R，HAMMED D A，BASHER H A.Potential pathogenic bacteria from dead in shell chicken embryos［J］.Journal of Veterinary Sciences，1992，5(2):109-114.

［6］ TIWARY B K，PRASAD L B.Enteric infection in livestock and poultry caused by Salmonellae and Shigella［J］.Vet Rec，1972，91(21):510-513.

［7］ 喻华英，胡文兵，陈长生.犊牛腹泻病中志贺氏菌分离与鉴定［C］//中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第14次学术研讨会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第13次学术会议论文集.石河子:中国畜牧兽医学会兽医病理学分会，2006:261-265.

［8］ 王彦红，苗小青，周 琼，等.奶牛大肠杆菌与鲍氏志贺氏菌混合感染的诊疗［J］.中国兽医杂志，2007，43(9):70-71.

［9］ 杨 雪，郭定宗，祝海宝，等.某猪场断奶腹泻仔猪致病菌的调查［J］.中国畜牧兽医，2007，34(8):114-116.

［10］高凤山，胡佳学.幼犬志贺氏菌感染的微生物学诊断［J］.安徽农学通报，2007，13(3):118.

［11］耿长国，彭广能，何春燕，等.袋鼠源志贺氏茵的分离鉴定［J］.中国兽医杂志，2009，45(11):33.

［12］邹 玲.一株鸭源志贺氏菌的分离鉴定与药敏试验［J］.中国畜牧兽医，2009，36(5):164.

［13］李 炜，蒋大伟，程 琨，等.鸡志贺氏菌多价凝集抗原及其标准血清的研制［J］.河南农业大学学报，2009，43(5):526-530.

［14］崔保安.动物微生物学［M］.第3版.北京:中国农业出版社，2005:391.

［15］张玉红，张光辉，许兰菊，等.河南省鸡志贺氏菌病和鸡白痢的血清流行病学调查［J］.河南农业科学，2007(12):105-108.

［16］陆承平.兽医微生物学［M］.第3版.北京:中国农业出版社，2001:29;216.

［17］杨 霞，陈 陆，许兰菊，等.鸡源鲍氏志贺菌 hn03株的分子鉴定与演化分析［J］.畜牧兽医学报，2009，40(3):408.

［18］李淑梅，杨 帆，刘兴友.豫北地区规模化鸡场病原菌及耐药性趋势的调查［J］.养禽与禽病防治，2008(9):7-9.