王凤雪，温永俊，刘 准，冷 雪，李真光，武 华，2

(1.中国农业科学院特产研究所，吉林 吉林132109;2.北京必威安泰生物科技有限公司，北京100176)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)主要以母猪发热、厌食、早产、流产、死胎、弱仔等繁殖障碍及各种年龄猪呼吸系统疾病、仔猪高死亡率、感染猪出现免疫抑制等为主要特征［1］，其病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV).20世纪80年代末期在美国和欧洲一些国家发现该病［2］.在1995年在中国多个省发现该病，郭宝清等［3］、杨汉春等［4］于 1996年分别从疑似PRRS的病例中分离出PRRSV.从2006年开始发生的猪高热病，是由PRRSV变异株引起的一种急性高致死性疫病，给中国养猪业造成了严重的经济损失［5］.PRRSV是一种单股、正链的RNA病毒，基因组全长约15 kb，具有8个开放阅读框(ORFs).根据病毒基因组的差异，PRRSV可分为2个基因型:欧洲型(以LV株为代表株)和美洲型(以ATCC VR-2332株为代表株).5'端长约12 kb的基因组ORF1(包括ORF1a和ORF1b)编码病毒复制酶和聚合酶等;3'端有6个读码框，编码 PRRSV的6种结构蛋白.PRRSV ORF1a和ORF1b 编码非结构蛋白 Nsp1 ～ Nsp12［6，7］，核苷酸和推导的氨基酸序列分析表明Nsp2是PRRSV高变区.Nsp2基因中可见点突变、核苷酸插入或突变等多种基因变化，这种情况不仅存在于北美与欧洲基因型之间，而且在同型之间也是如此［8～14］.本研究根据病毒分子生物学原理，以分离于天津猪场的PRRSV TJ株及其致弱毒TJM株为研究对象，对易变区非结构蛋白Nsp2进行分子克隆测序及结构的分析，旨在为进一步研究该病毒的致病机理、毒力变化及致弱等提供基础.

1 材料与方法

1.1 病毒

PRRSV TJ株由中国农业科学院特产研究所人兽共患病研究室分离、鉴定、保存.TJM株系由TJ株在敏感细胞系Marc-145细胞上传代至92代获得.MARC-145细胞，由中国农业科学院特产研究所人兽共患病研究室保存.

1.2 主要试剂

各种限制性内切酶，ExTaq DNA Polymerase，dNTP，AMV反转录酶，T载体试剂盒等均购自宝生物工程(大连)有限公司.RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司.其余试剂为国产分析纯产品.

1.3 菌种与载体

大肠杆菌DH5α由中国农业科学院特产研究所人兽共患病研究室提供，pMD18-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司.

1.4 引物

根据VR-2332美洲株基因组，设计1对引物扩增包括非结构蛋白Nsp2的一段基因，预期扩增片段3 602 bp，引物由英维捷基(上海)贸易有限公司(Invitrogen)公司合成，具体引物序列如下:Nsp2-F:5’-CAGGGTTGAGCCCAATACG0-3’，Nsp2-L:5’-GCAAGGCAGCAATGAGGTG-3’.

1.5 病毒RNA的提取

按照Invitrogen公司RNA提取试剂Trizol使用说明进行.

1.6 RT-PCR 反应

1.6.1 反转录(RT)20μL反转录体系中，反转录引物OligodT 1 μL，RNA 5 μL，70 ℃加热10 min，冰浴10 min;再加入5 倍 AMV buffer 4 μL，10 mmol·L-1dNTP 2 μL，RNasin 0.5 μL，AMV 反转录酶 1 μL，DEPC H2O 6.5μL，充分混合后离心，经42℃ 60 min，95℃灭活AMV反转录酶，立即于冰上冷却，进入PCR.

1.6.2 PCR 反转录产物5μL，10倍 PCR buffer 5 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 4 μL，上下游引物各 1 μL，ExTaq DNA Polymerase 0.5 μL，加水补足 50 μL.优化PCR循环参数，确定PCR的最佳反应程序为:95 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，56.6 ℃ 45 s，72 ℃ 3 min 30 s，35个循环，72 ℃ 延伸 10 min.取 5 μL PCR产物，进行质量分数为0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，观察产物扩增效果和片段大小.

1.7 PCR产物的克隆与测序

将扩增的各基因产物分别回收后与载体pMD18-T连接，转化DH5α感受态细胞，经Amp+抗性筛选，酶切鉴定正确的克隆送英维捷基(上海)贸易有限公司测序.

1.8 Nsp2基因的序列分析

使用DNAStar和Clustal W软件对PRRSV TJ株和TJM株Nsp2基因进行分析，并与标准参考毒株序列进行比较;使用RNAdraw，MFOLD等软件，以最佳结构或碱基配对性的矩阵算法，对2级结构进行预测，并深入分析它们的协同变异性，进而分析它们的衍化关系.

2 结果与分析

2.1 PRRSV Nsp2的RT-PCR扩增

以PRRSV TJ株和TJM株RNA为模板合成第一链cDNA，利用所设计的引物对Nsp2-F与Nsp2-L，PCR反应扩增出目的片段，PRRSV TJ株Nsp2大小与预期结果一致，而细胞致弱毒株TJM株Nsp2偏小(图1).

2.2 PRRSV Nsp2编码区PCR产物的克隆鉴定

2个毒株的Nsp2的RT-PCR产物经克隆、转化及酶切鉴定，得到目的片段为3 602 bp，证明获得了PRRSV阳性重组子(图2).

2.3 PRRSV TJ株和TJM株Nsp2的结构分析

2.3.1 1级结构分析 测序结果与北美型经典代表株VR-2332株Nsp2比较发现，PRRSV TJ株Nsp2长2 850 bp，与VR-2332株Nsp2(2 940 bp)相比有较大差异，核苷酸序列同源性只有83.6%;推导氨基酸同源性77.9%.TJM株与VR-2332的核苷酸序列同源性为82.9%，推导氨基酸同源性为75.5%.与经典株VR-2332相比，PRRSV高致病性毒株TJ株Nsp2基因具有特征性的不连续的30个氨基酸(90个碱基)的缺失，这也是最近多个研究机构分离的高致病性 PRRSV 毒株的共性［15，16］.来源于 TJ株的细胞致弱毒株TJM株Nsp 2的序列除了具有该共性以外，还出现了另一段120个氨基酸(360个碱基)的整段缺失(图3).

2.3.2 2级结构分析 运用 RNAdraw软件对PRRSV TJ分离株、PRRSV TJM分离株和经典毒株VR-2332基因组RNA中Nsp2的2级结构进行预测，结果见图4.从图4可知，PRRSV TJ株Nsp2可形成多种形态的结构域，多数是简单的茎环结构，也有2个内部环或几十个碱基组成的发夹结构;TJM株Nsp2在结构上比TJ株少了1个大的分支;而经典株VR-2332的结构域和茎环结构与本试验毒株相比均有很大的不同，这也充分说明Nsp2是PRRSV基因组中变异性比较大的区域之一.

3 讨论

1)在PRRSV分子生物学研究中，通过核苷酸测序和推导的氨基酸序列比较分析表明，Nsp2是PRRSV高变区，Nsp2编码区中核苷酸的点突变、碱基单个或多个的插入与缺失普遍存在于北美洲型与欧洲型PRRSV.基因组最长的PRRSV疫苗株SP的Nsp2氨基酸与北美洲型和欧洲型的Nsp2相比，分别在近C端插入了36和155个氨基酸［10］.而日本分离株EDRD-1除了像SP一样插入了一段完全不同的108个碱基，还多了一段117个碱基的缺失［11］.北美洲基因型一般与标准毒株VR-2332比较，HB-2(sh)/2002株Nsp2在不同的位置缺失12个氨基酸［12］;而 MN184株 Nsp2在 324～434，486和505～523位发生111，1和19个氨基酸的不连续缺失［8］;2006年引起中国高致病性蓝耳病的PRRSV流行株的共性是在480和531～559位发生30个氨基酸的不连续缺失.本研究中高致病性PRRSV TJ株也存在同样的缺失，其细胞致弱株TJM株Nsp2在此缺失仍然存在的情况下发生了进一步的片段缺失，该段缺失为120个氨基酸整段缺失，比以往发现的PRRSV毒株Nsp2缺失片段都大.推测TJM株Nsp2蛋白的这120个氨基酸的缺失可能与PRRSV的毒力致弱有关.PRRSV欧洲株Nsp2序列也存在相似的缺失或插入情况.与LV相比，SD01-08株和 EuroPRRSV的 Nsp2在氨基酸734～750位之间有17个缺失(51个核苷酸)，并且推测欧洲型Nsp2氨基酸缺失区及氨基酸高变区是免疫重要区［13，14］.

图3 TJ株和TJM株Nsp2编码区氨基酸序列与经典株VR-2332 Nsp2编码区氨基酸序列比较Fig.3 The deletion of Nsp2-coding region of TJ and-TJM comparing to VR-2332

图4 PRRSV TJ株(A)，TJM株 (B)，VR-2332株(C)Nsp2 RNA 2级结构预测比较Fig.4 Analysis of secondary structure of the Nsp2 of PRRSV TJ strain(A)，TJM strain(B)and VR-2332 strain(C)

2)PRRSV基因组为单股正链RNA，具有感染性.核酸分子RNA是单链结构，单链RNA的三维结构是由它的核苷酸序列决定的.目前RNA2级结构预测有2种主要的方法，一是基于序列比较的方法，另一种方法是能量最小化方法.能量最小化方法在预测RNA分子2级结构时，试图对RNA折叠的自由能进行最小化，进而搜索最稳定的结构.Zuker的Mfold程序是使用较多的程序包之一，它就是通过一系列的最近邻能量规则来计算一个结构的能量.通过软件预测发现，PRRSV TJ株Nsp2可形成多种形态的结构域，从5’端开始包括占多数的茎环结构，也有2个内部环或几十个碱基组成的发夹结构，整个Nsp2 RNA结构较为紧凑，结构主线较直;细胞致弱株TJM株Nsp2在结构上比TJ株少了1个分支，有更多的发夹结构，结构主线分叉明显;而经典株VR-2332的结构域和茎环结构与本试验毒株TJ和TJM相比均有很大的不同，看起来更简单，这也充分说明Nsp2是PRRSV基因组中变异性比较大的区域之一.

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