何浩，汪道文

(1.安徽医科大学附属省立医院、安徽省立医院心血管内科，合肥230001;2.华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科)

经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后再狭窄一直是其主要的并发症而影响其远期疗效。尽管药物洗脱支架(DES)明显改善了其近期疗效，但由于冠脉狭窄的原因及机制较为复杂，因而有关PCI的很多问题仍悬而未决。其多数学者认为［1］，PCI直接导致血管组织损伤，血小板粘附和激活，促进血管平滑肌细胞迁移和增生而导致管腔狭窄，这是其最主要机制，血小板和血管平滑肌细胞(VSMCs)在再狭窄发生和发展过程中起关键性作用。本文着重探讨中药穿心莲对血管成形术后血小板促血管平滑肌细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 动脉粥样硬化(AS)动物模型和腔内血管成形术(TA) 选正常3～4周龄日本大耳白兔10只(由华中科技大学同济医学院附属同济医院动物实验中心提供)，每日每只兔给饲含胆固醇0.5g、猪油1.0 g的标准混合饲料。1周后打开家兔腹腔，暴露其腹主动脉，用无齿镊轻夹动脉3次，通过挤压和摩擦作用损伤动脉内膜，长度3 cm。术后关闭腹腔，继续给高脂饲料。4周后以76%泛影葡胺进行血管造影。血管造影见狭窄后，对狭窄段血管进行TA术，共6只。选直径3.0 mm的Gruentzig球囊导管，在导丝引导下以4个标准大气压进行充液扩张，连续3次，每次持续30 s，直至狭窄段被充分扩开。

1.2 VSMC培养 分别取正常段、AS狭窄段及TA后40 h的扩张段腹主动脉中膜组织进行VSMCs培养，原代细胞培养采用组织贴块法，培养液为含100 ml/L胎牛血清(美国 Gibco Lab)的 Eagle培养基(日本制药株式会社)，用5%碳酸氢钠将培养液PH值调至7.0。置于含5%CO2、37℃细胞培养箱中下静置培养。培养1～2周后细胞长满瓶壁，用0.1%胰蛋白酶化融合的细胞，进行常规传代培养。选其3～4代生良好的细胞进行分组实验。

1.3 细胞计数 用0.1%胰蛋白酶消化上述各组细胞，将细胞悬液浓度制成3×108/L后，在24孔培养板中培养24 h后进行分组实验。正常、AS狭窄段及TA后3组VSMCs各分成3个亚组，分别向3个亚组培养孔中加人:(1)穿心莲(为二次提取物，华中科技大学同济医学院附属同济医院赠，终浓度100 mg/L);(2)血小板(2.0×108/L ，以二磷酸腺苷(ADP)诱聚激活，诱聚浓度3μmol/L);(3)穿心莲+血小板(终浓度同前，旨在用穿心莲对血小板进行预处理;(4)ADP(终浓度3μmol/L);(5)细胞培养液(对照组)，以观察不同刺激物对VSMCs生长的影响。另对扩张前的AS段细胞培养孔中加入等量培养液，与TA－VSMCs对照组进行比较，观察两者生长速度的快慢。每个亚组在培养板上设4～6孔，每孔总体积1.3 ml，再培养36 h后终止试验，重复试验3次。最后在光镜下直接进行细胞计数。

1.4 125碘一尿嘧啶脱氧核苷(125I—UdR)参入另将各组细胞浓度制成3×108/L，24孔细胞培养板中每孔加入细胞悬液1 ml，培养24 h后开始分组实验，具体分组方法同细胞计数实验分组。加入刺激物和培养液后再加入标记物125I－UdR，每孔1微居里(μCi)，继续培养16 h后终止实验，重复实验3次。以微孔滤膜(孔径0.45μm)分离VSMCs，将滤膜置于试管中，以γ闪烁计数器(FJ 2017)测定每管的放射性强度，以每分钟的放射计数率(cpm)大小来反映VSMCs内DNA的合成量多少。

2 结果

2.1 AS狭窄段和TA后40 h的VSMCs增殖的变化 TA后40 h的VSMCs组细胞计数和放射计数率均较术前AS狭窄段VSMCs组有所增加，但差异无统计学意义，见表1。

表1 AS狭窄段及TA后VSMCs的细胞计数及放射计数率

2.2 激话的血小板对TA前后VSMCs增殖的直接作用 如表l所示，AS狭窄段VSMCs组在加入血小板悬液培养后，与同种细胞对照组相比，其细胞计数及放射计数率均明显增加，差异有统计学意义。而加人血小板诱聚剂ADP培养的VSMCs组与为穿心莲处理的VSMCs组比较，其细胞计数和放射计数率均明显降低，差异有统计学意义。

3 讨论

Clowes等［2］早期就有发现，用球囊剥脱动脉内皮后，VSMCs增殖在2～3 d达到高峰。本研究结果显示，TA后40 h较TA前AS狭窄段的VSMCs的细胞计数及放射计数率虽有所增加(约22%左右)，但无显著性差别，这正说明TA后40 h的VSMCs繁殖可能有加快趋势但此时的VSMCs尚未达到增殖高峰。这可能是部分VSMCs已开始增殖，而另一部分则处于增殖前或静止期状态。

Friedman等［3］对血小板减少的家兔内皮进行球囊剥脱损伤，结果这些家兔的动脉损伤段的内膜增厚明显不如血小板计数正常的对照组家兔。这一研究间接证明了血小板对内膜增生的促进作用。本研究结果表明，激活的血小板对TA前后的VSMCs增殖具直接的作用。加入血小板的VSMCs组较自身对照纽的细胞计数和放射计数率均明显增加。而血小板诱聚剂ADP对VSMCs增殖则没有影响。这说明血小板对VSMCs的作用归因于血小板释放的其他活性物质，如生长因子。无齿镊钳夹挤伤和TA术球囊撕裂损伤内膜，使内皮下胶原纤维和弹力纤维暴露，血小板在局部粘附聚集并释放出包括血小板源生长因子(PDGF)等在内的一些活性物质，刺激VSMCs增生。VSMCs增殖是一种组织损伤后的修复反应［1］，但过度增生则使内膜增厚而形成管腔的再狭窄。

有报道，发现穿心莲(APN)提取物能明显抑制ADP和肾上腺素诱导的血小板聚集反应［4］，并可抑制血管平滑肌细胞的增生［5］。API预防用药能够显著减少主动脉脂质斑块面积［6］，从而减少动脉粥样硬化性狭窄的发生率［7］。本实验结果提示，加入穿心莲对血小板进行预处理后，改组细胞计数和放射计数率均较未加血小板处理的血小板组明显减少，说明穿心莲能抑制血小板活性物质所致的VSMCs的增生，提示穿心莲对PCI后血小板促VSMCs增生等组织修复反应导致的血管再狭窄可能是值得进一步研究的药物。关于其机制，尚不十分清楚，可能是与穿心莲使血小板内使前列环素(PGI2)、环磷酸腺苷(cAMP)含量增多，纤溶酶原激活物抑制物(PAI)活性降低有关［5］，升高的cAMP可以抑制血小板的活性［8］。

［1］ 高志国，黄鹤，陈宏才，等.经皮冠状动脉腔内成形术后再狭窄机制的研究进展［J］.实用医学进修杂志，2000，28(108):76-79.

［2］ Clowes AW.Significance of quiwscent smoothmusclemigration in the njured rat carotid arterty［J］.Circulation research，1985，56(2):139-145.

［3］ Friedman RI.The effect of thrombocytopenia on experimented arteriosclerotic lesion formation in rabbit［J］.J Clin Invest，1977，60(5):1190-1210.

［4］ 方淑贤，郑恒，刘东，等.穿心莲内酯对二磷酸腺苷诱导血小板聚集的拮抗作用［J］.医药导报，2004，23(11):806-808.

［5］ 吴露，邓常青.中药防治经皮冠状动脉成形术后血管再狭窄研究进展及思考［J］.中国中医药信息杂志，2008，15(2):79-81.

［6］ 张杰，徐列明.中药对血小板源生长因子的调控作用研究进展［J］.中西医结合学报，2004，2(3):99-101.

［7］ 汪道文，赵华月，汤执云.穿心莲提取物预防粥样硬化性动脉狭窄的实验研究［J］.中国循环杂志，1994，9(5):295-298.

［8］ Gorman RR.Medulation of human platelet adenlate by prostacyclin［J］.Prostaglandins，1977，13(3):377-382.