宣柳，李筱青，盛晓蓉

(安徽省医学科学研究院，合肥230016)

CD4+CD25+Fox p3+调节性T细胞(Treg)是近年来发现的不同于Th1和Th2的细胞，其数量和功能的改变对调控机体的免疫应答具有重要的作用。有研究显示［1-2］:Treg对多种刺激呈低反应状态，并能抑制CD4+和CD8+T活化和增殖，与多种疾病的发生发展相关;但有关Treg如何调节T辅助淋巴细胞(Th1/Th2)细胞因子，以及在乙型肝炎慢性化中所起作用的研究鲜有报道。本研究采用ELISA和流式细胞术分别对乙型肝炎患者(CHB)、正常人群外周血检测Th1/Th2细胞因子和Treg分布频率，从细胞免疫方面探讨乙型肝炎的慢性化机制。

1 对象和方法

1.1 对象 20例CHB为安徽医科大学第二附属医院2010年2月至2010年7月收治并临床确诊的病例，符合2005年中华医学会、感染病学分会《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准［3］;所有病例均排除合并其他肝炎病毒感染、自身免疫性、乙醇性肝病以及重症肝病等患者，未经任何免疫抑制剂治疗;并选20例性别和年龄相同的健康体检者作为研究对照。

1.2 主要实验仪器和试剂 流式细胞仪型号:Benkman Coulter 3XL(美国产);Fox P3-FITC、CD25-PE-Cy5、CD4-PE、pH7.2-7.4 磷酸盐缓冲液和红细胞裂解液均购自美国BD公司。

1.3 检测方法 用于测定细胞因子的血清冻存于－30℃，γ 干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-2、IL-4和IL-10的测定采用ELISA方法，每样本均检测双孔取均值，试剂盒系美国Genzyme公司产品，由深圳晶美生物工程公司分装。上述实验均按说明书程序操作。用流式细胞仪检测 CD4+CD25+Fox p3+Treg，取新鲜采集的 EDTA抗凝血1 ml，2 h内进行细胞表型分析。取抗凝血100μl，各加入10μl CD4-PE、CD25-PE-Cy5，再加入1m l经过稀释的固定、透膜剂，反应30min后，以透膜缓冲稀释液洗涤并重悬，再加入10μl FITC标记的抗人FoxP3抗体，反应30 min后洗涤，以400μl冷PBS重悬，测定。

表1 两组血清细胞因子的比较( ± s，ng/L)

表1 两组血清细胞因子的比较( ± s，ng/L)

注:与健康对照组比较，a P＜0.05

IL-2 IL-4 IL-10健康对照组 20 31.61 ±14.35 49.02 ±18.33 9.89 ±5.34 24.77 ±组别 例数 IFN-γ 11.96慢性乙型肝炎组 20 35.64 ±15.31 35.53 ±14.23a 16.63 ±6.61a 38.53 ±14.46a

2 结果

2.1 细胞因子检测 与健康对照组相比，CHB组的IL-2明显减低(P＜0.05)，IL-4和IL-10均明显增高(P ＜0.05)，见表1。

2.2 外周血 Treg水平 CHB患者组Treg细胞占CD4+T淋巴细胞的百分比［(5.72±0.94)%］明显高于健康对照组［(4.60 ±0.66)%］，P ＜0.05。

3 讨论

叉头翼状螺旋转录因子(Fox p3)在调控Treg的发育上起着重要作用。研究证明［4-5］，Fox p3在Treg特异性表达，并与它的分化发育和功能成熟密切相关，这在一定程度上可反映Treg的水平和功能活性。本研究结果发现，CHB外周血Treg占CD4+细胞的5.72%左右，明显高于健康对照组，这与Stoop 等报道一致［2］。

据所产生细胞因子的功能不同，辅助性T淋巴细胞(Th)可分为Th1和Th2细胞。Th1细胞产生IFN-γ、IL-2等细胞因子，主要介导细胞免疫应答。Th2细胞产生IL-4、IL-10和IL-13等，主要功能为促进B淋巴细胞发育和介导体液免疫应答。一般认为，Th1免疫应答增强宿主对微生物感染;而Th2应答则与感染的进展、持续性和慢性化有关［6］。本研究显示:慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者的IL-2水平明显低于健康对照组，而IL-4、IL-10明显高于健康对照组。因而认为，一方面由于病毒感染，Th1/Th2细胞在体内均被激活，血液中细胞因子水平有升高的趋势，但另一方面Treg能抑制Th1/Th2细胞的活化和增殖，且Treg对Th1的抑制作用明显强于Th2。

总之，在CHB组中，Treg分布频率较高，使得CHB的Th2的应答增强，可能是HBV感染慢性化的作用机制之一。这反映出宿主的一种自身保护机制，即人体试图通过调节降低免疫/炎性反应，来减弱乙型肝炎的炎症过程，从而减轻肝细胞损伤，同时也使宿主不能有效清除HBV，导致感染的慢性化。

［1］ Franzes O，Kennedy PT，Gehring AJ，et al.Modulation of the CD8+T-cell response by CD4+CD25+regulatory T cells in patients with hepatitis B virus infection［J］.J Virol，2005，79(6):3322-3328.

［2］ Stoop JN ，vander Molen RG ，Baan CC ，et al.Regulatory T cells contribute to the impaired immune response in patients with chronic hepatitis B virus infection［J］.Hepatology，2005，41(4):771-778.

［3］ 中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南［J］.中华内科杂志，2006，45(2):162-170.

［4］ Hori S，Nomura T，Sakaguchi S，etal.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3［J］.Science，2003，299(5609):1057-1061.

［5］ Ramsdell F ，Ziegler SF.Transcription factors in autoimmunity［J］.Curr Opinin Immunol，2003，15(6):718-724.

［6］ Modlin RL，Nutman TB.Type 2 cytokines and negative immune regulation in human infections［J］.Curr Opin Immunol，1993，5(4):511-514.