孙凤娥 王蕾 周慧敏

近年来，糖尿病患者恶性肿瘤发生率明显增加。大量研究显示，糖尿病与乳腺癌的发生发展密切相关［1］。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在抑制肿瘤免疫、促进肿瘤血管形成中发挥重要作用，对恶性肿瘤的发生发展及预后具有重要意义［2］。目前有关葡萄糖和胰岛素对4T1肿瘤细胞分泌VEGF的影响，笔者尚未见相关研究报道。本实验体外检测不同浓度的葡萄糖和胰岛素对4T1肿瘤细胞VEGF分泌的影响，为分析糖尿病与乳腺癌发生、发展的关系提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 实验用肿瘤细胞株为小鼠乳腺癌细胞株(4T1肿瘤细胞，河北医科大学免疫学教研室冻存);RPMI 1640细胞培养基为海克隆生物制品有限公司产品;胎牛血清为ExCell Biology，Inc.产品;胰岛素为江苏万邦生化医药股份有限公司产品;葡萄糖、青霉素、链霉素均为华北制药有限公司产品;小鼠VEGF酶联免疫试剂盒为美国R＆D公司产品。

1.2 4T1肿瘤细胞的培养 4T1肿瘤细胞复苏后，接种于RPMI 1640培养基(其中含10%的胎牛血清，100 U/ml的青霉素，100 μg/ml的链霉素)中，置于 37℃、5%CO2的培养箱培养，约24～48 h换液1次，当细胞生长至90%以上时进行传代。

1.3 实验分组 取对数生长期的4T1肿瘤细胞进行分组实验。根据培养液加入葡萄糖和胰岛素浓度的不同，将实验所用细胞分为15组:A组(对照组)只加RPMI 1640培养液(不含葡萄糖和胰岛素);B组RPMI 1640培养液+5mmol/L葡萄糖;C组RPMI 1640培养液+10 mmol/L葡萄糖;D组RPMI 1640培养液+25 mmol/L葡萄糖;E组RPMI 1640培养液+35 mmol/L葡萄糖;F组RPMI 1640培养液+5μU/ml胰岛素;G组RPMI 1640培养液 +25μU/ml胰岛素;H组 RPMI 1640培养液 +125 μU/ml胰岛素;I组 RPMI 1640 培养液 +250 μU/ml胰岛素;J组RPMI 1640培养液 +1.25 μU/ml胰岛素;K 组 RPMI 1640培养液+5 mmol/L葡萄糖+5 μU/ml胰岛素;L组RPMI 1640培养液+5 mmol/L葡萄糖+125 μU/ml胰岛素;M组RPMI 1640培养液+25 mmol/L葡萄糖+125 μU/ml胰岛素;N组RPMI 1640培养液+25 mmol/L葡萄糖+5 μU/ml胰岛素;O组RPMI 1640培养液 +25 mmol/L葡萄糖 +1.25 μU/ml胰岛素。

1.4 实验各组4T1细胞培养上清的制备 将对数生长期的4T1细胞接种于6孔细胞培养板中，浓度为2×105/ml，15个实验组每组均设双复孔，每孔培养液均为3 ml，置于37℃，5%CO2的培养箱培养。48 h后收集细胞培养上清，离心3000 r/min 20 min，－20℃保存。

1.5 ELISA法检测4T1细胞培养上清中VEGF的含量 采用双抗体夹心法。严格按小鼠VEGF定量检测试剂盒(ELISA)说明书操作。通过绘制标准曲线，计算样品中VEGF的浓度。

1.6 统计学分析应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以表示，进行单因素方差分析和t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度的葡萄糖对4T1细胞分泌VEGF的影响 含有不同浓度葡萄糖的B、C、D、E组细胞培养上清中VEGF的浓度［分别为(123±13)pg/ml、(127 ±12)pg/ml、(129 ±13)pg/ml、(125±10)pg/ml］与 A组［(115±7)pg/ml］比较差异均无统计学意义(P ＞0.05)。

2.2 不同浓度的胰岛素对4T1细胞分泌VEGF的影响 F组、G组和J组细胞培养上清中VEGF的浓度［分别为(125±12)pg/ml、(130 ±10)pg/ml］和［(128 ±11)pg/ml］与 A 组比较均无统计学意义(P＞0.05);但是随着胰岛素浓度的变化，含有高浓度胰岛素的 H组、I组(培养液分别含有125 μU/ml、250 μU/ml的胰岛素)细胞培养上清中VEGF的浓度［分别为(151±9)pg/ml、(153±11)pg/ml］与 A组比较均有统计学意义(P＜0.05)，但H组和I组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 不同浓度的葡萄糖和胰岛素同时作用对4T1细胞分泌VEGF的影响 L组和M组细胞培养上清中VEGF的浓度［分别为(151±11)pg/ml和(150±14)pg/ml］与A组比较差异有统计学意义(P＜0.05);而K组、N组和O组细胞培养上清中VEGF的浓度［分别为(126±14)pg/ml、(130±17)pg/ml和(130±15)pg/ml］与A组比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。

3 讨论

在2型糖尿病病程中，经常存在不同程度的胰岛素抵抗和高胰岛素血症。以往的研究显示，胰岛素在高浓度时能引起兔视网膜Muller细胞VEGF分泌增加及其mRNA表达增加［3］;对糖尿病大鼠进行胰岛素治疗，发现胰岛素可导致VEGF mRNA表达量和VEGF含量增加［4］;而应用胰岛素治疗糖尿病患者也有类似发现［5］。有学者应用胰岛素作用于结直肠癌肿瘤细胞，显示胰岛素能促进肿瘤细胞分泌VEGF［6］。本实验结果与以往这些研究结果相似。国外学者通过对胰腺癌的研究提出，高浓度胰岛素上调肿瘤细胞VEGF mRNA的表达、增加VEGF分泌的机制是通过结合IGF-I受体所致［7］。胰岛素和IGF-1与彼此受体间存在交叉结合现象［8］，胰岛素在高浓度时既能与胰岛素受体结合，也能与IGF-I受体结合。

VEGF可由某些肿瘤细胞、肿瘤间质细胞和单核巨噬细胞产生。一方面，VEGF可直接刺激血管内皮细胞增殖，形成新生血管［9］，有利于肿瘤的生长、浸润和转移;另一方面，VEGF可通过发挥免疫抑制作用，促进肿瘤的发生发展:(1)抑制树突状细胞(DC)的分化、成熟及抗原提呈功能［10］;(2)抑制细胞毒T细胞(CTL)特异性杀伤靶细胞的功能;(3)抑制凋亡因子的表达，阻止肿瘤细胞凋亡［11］。

有资料显示，乳腺癌组织中VEGF的表达水平与肿瘤组织的微血管密度呈正相关，与乳腺癌转移、复发、生存率明显相关［12］，表明VEGF对乳腺癌的发生发展及预后具有重要作用。因此，对于糖尿病患者以及糖尿病伴有乳腺癌的患者，应控制胰岛素抵抗和高胰岛素血症，减少VEGF的分泌，以阻止乳腺癌的发生发展及转移。

1 Jordan S，Lim L，Vilainerun D，et al.Breast cancer in the Thai Cohort Study:An exploratory case-control analysis.Breast，2009，18:299-303.

2 韩文峰，魏素菊.VEGF-A在肿瘤中的研究进展.河北医药，2010，32:214-216.

3 Song E，Wang YH，Xu Q，et al.Effects of high concentrations insulin on VEGF expression in cultured Muller cells.Zhonghua Yan Ke Za Zhi，2004，40:40-44.

4 Kobayashi T，Kamata K.Short-term insulin treatment and aortic expressions of IGF-1 receptor and VEGF mRNA in diabetic rats.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002，283:H1761-1768.

5 Poulaki V，Qin W，Joussen AM，et al.Acute intensive insulin therapy exacerbates diabetic blood-retinal barrier breakdown via hypoxia-inducible factor-1alpha and VEGF.J Clin Invest，2002，109:805-815.

6 周慧敏，刘凤娟，张素敏，等.葡萄糖、胰岛素对Colon26肿瘤细胞分泌VEGF的影响.第四军医大学学报，2009，30:2119-2121.

7 Zeng H，Datta K，Neid M，et al.Requirement of different signaling pathways mediated by insulin-like growth factor-I receptor for proliferation，invasion，and VPF/VEGF expression in a pancreatic carcinoma cell line.Biochem Biophys Res Commun，2003，302:46-55.

8 Lawrence MC，McKern NM，Ward CW.Insulin receptor structure and its implications for the IGF-1 receptor.Curr Opin Struct Biol，2007，17:699-705.

9 Sato Y，Abe M，Tanaka K，et al.Signal transduction and transcriptional regulation of angiogenesis.Adv Exp Med Biol，2000，476:109-115.

10 Ohm JE，Carbone DP.VEGF as a mediator of tumor-associated-immuno-deficiency.Immunol Res，2001，23:263-272.

11 Beierle EA，Strande LF，Chen MK.VEGF upregulates Bcl-2 expression and is associated with decreased apoptosis in neuroblastoma cells.J Pediatr Surg，2002，37:467-471.

12 李宏江，敬静，汪静，等.乳腺癌血管内皮生长因子与微血管密度的分布及与预后的关系.肿瘤学杂志，2002，8:215-217.