连 锋 薛 松 顾 萍 张谷兰 吴学军 朱洪生

低氧环境和血清饥饿对内皮祖细胞死亡率的影响

连 锋 薛 松 顾 萍 张谷兰 吴学军 朱洪生

目的 探讨低氧环境和血清饥饿对骨髓来源内皮祖细胞死亡率的影响。方法 取SD大鼠骨髓，分离出内皮祖细胞，并用免疫荧光法鉴定。取第2代细胞，分别在常氧环境（21%O2）合并正常血清（20%浓度）或血清饥饿（0%、2%浓度）条件下培养48 h，或是低氧环境（3%O2）合并正常血清或血清饥饿条件下培养 48 h、72 h、96 h、120 h。用Live/ Dead染色，结合图像分析，计算细胞死亡率。结果 短期处于低氧环境中，内皮祖细胞的死亡率无明显变化（P＞0．05）。在血清饥饿条件下，细胞死亡率显著升高（P＜0．01）。如果长期处于低氧环境中，与正常血清培养相比，血清饥饿培养时细胞死亡率显著升高（P＜0．01），72 h时达（96．30±3．18）%，120 h时达100%。结论 缺氧环境和血清饥饿对内皮祖细胞的存活均有不良影响，其中血清饥饿的影响更大。

内皮祖细胞 血清饥饿 缺氧 死亡率

内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cell，EPCs）参与血管建立的两个过程：血管发生（Vasculogenesis）和血管生成(Angiogenesis)[1-2]。研究发现，EPCs移植到缺血心肌后，能改善心功能，因此有望用于缺血性心脏病的干细胞治疗[3-4]。目前主要的技术瓶颈是，移植后不久EPCs即大量死亡，有研究表明，短期内绝大多数移植于缺血心肌的干细胞死亡，导致移植效果不够理想[5-6]，我们考虑这可能与病变局部缺血和缺氧有关。为验证这一设想，本实验在低氧和血清饥饿环境中培养EPCs，并比较不同培养条件下的细胞死亡率。

1 材料和方法

1.1 动物

SD大鼠，雄性，6～8月龄，体质量300～350 g（上海交通大学医学院附属仁济医院实验动物中心）。

1.2 实验材料

戊巴比妥钠 （上海化学试剂公司）；IMDM培养基(Invitrogen，美国)；胎牛血清（Invitrogen,美国）；0．25%胰蛋白酶（Gibco，美国）；血管内皮生长因子（VEGF，Sigma，美国）；碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，Sigma，美国）；淋巴细胞分离液（中国科学院生物工程研究所）；纤维粘连蛋白 （FN，Sigma，美国）；兔抗鼠 CD31抗体（Santa cruz，美国）；兔抗鼠CD34抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；兔抗鼠Flk-1抗体（Santa cruz，美国）；兔抗鼠vWF抗体（DAKO，丹麦）；激光共聚焦显微镜（Carl Zeiss，德国 ），Live/Dead viability/cytotoxicity kit（Molecular Probes，美国）。

实验用培养液含有低糖 IMDM，胎牛血清（FBS），血管内皮生长因子 （VEGF）30 μL/mL和bFGF 10 μL/mL。

1.3 EPCs的分离、培养

1%的戊巴比妥钠（30 mg/Kg）腹腔内注射麻醉SD大鼠。大鼠仰卧位，固定在手术台上，下肢备皮消毒。逐层切开皮肤、肌肉，暴露股骨，剪开股骨两端，用含肝素4 000 IU的生理盐水10 mL反复冲洗骨髓腔，所得骨髓液用IMDM稀释备用。

采用密度梯度离心法，淋巴细胞分离液密度1．088，2 000 r/min离心25 min，然后用毛细吸管吸取中间云雾层（即单核细胞层）。置入另一离心管，加入5倍体积的IMDM洗涤2次，每次1 300 r/min离心5 min，弃上清，加入IMDM重悬细胞。以1×106cell/mL的浓度接种到涂有FN的培养皿，加入培养液，将培养皿置入37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱。3 d后更换培养液，同时弃去未贴壁的细胞，此后每隔3天换液。10 d左右，待贴壁细胞几乎完全铺满培养皿底，用0．25%胰蛋白酶消化、传代。

1．4 EPCs的鉴定

取第2代EPCs以1×104cells/mL浓度接种到32 mm培养皿（内置玻片）。培养7 d后用免疫荧光染色法鉴定内皮标志物CD31、CD34、Flk-1和vWF。操作步骤如下：加入40 g/L的多聚甲醛，在4℃下固定20 min,PBS洗涤3次；0．01%Triton-X 100孵育3 min，PBS洗涤3次；滴加3%双氧水，室温下孵育10 min，PBS洗涤3次；滴加50 g/L牛血清白蛋白（BSA），室温下封闭60 min。在不同的玻片上，分别滴加兔抗鼠CD31抗体、兔抗鼠CD34抗体、兔抗鼠Flk21抗体和兔抗鼠vWF抗体，均以1∶200的比例稀释，4℃下过夜。PBS洗涤3次，每次5 min，然后分别滴加1∶100山羊抗兔IgG2FITC，37℃下孵育2 h，再用PBS洗涤3次，每次5 min。用甘油PBS封片后,在激光共聚焦显微镜下观察、记录。对照玻片，加一抗时用PBS替代，作为阴性对照。

1.5 实验分组和处理

取处于对数生长期的第2代EPCs，分别在常氧环境（21%O2）合并正常血清（含20%FBS）或血清饥饿（含0%、2%FBS）条件下培养48 h，或是低氧环境（3%O2）合并正常血清或血清饥饿条件下培养 48 h、72 h、96 h、120 h。每组设3孔。

1.6 细胞死亡率测定

参照试剂盒说明书，分别测定各组EPCs的死亡率。钙黄绿素AM（Calcein AM）与活细胞的膜结合，发绿色荧光；而溴乙非啶同型二聚体（Ethidium homodimer，EthD-1）与受损细胞的核酸结合，发红色荧光。用Leica QWIN图像处理及分析系统，计数100个细胞，红色细胞百分比即为细胞死亡率。每份标本重复计数3次，取平均值进行统计学分析。

1.7 统计学分析

数据用均数±标准差表示。采用SPSS 10．0软件进行方差分析，Bonferroni法进行组间比较。P＜0．05提示差异具有统计学意义，P＜0．01提示差异具有高度统计学意义。

2 结果

2.1 内皮祖细胞的鉴定

免疫荧光染色结果显示，贴壁细胞 CD31、CD34、Flk-1和vWF染色阳性，7 d时90%的贴壁细胞能摄取Dil-LDL（图1～4）。

2.2 低氧环境和血清饥饿对大鼠EPCs死亡率的影响

在常氧环境下培养48 h，2%和0%FBS之间没有统计学差异（P＞0．05），但上述两组和20%FBS组死亡率相比有明显的统计学差异（P＜0．01）。在低氧环境下培养48 h，20%FBS组的细胞死亡率明显高于0%和2%FBS组（P＜0．01)，而2%和0%FBS之间没有统计学差异（P＞0．05）。采用相同浓度的血清培养EPCs，低氧组和常氧组的细胞死亡率没有统计学差异（P＞0．05）（表1）。与短期低氧（48 h）相比，长期低氧（72 h、96 h、120 h）时血清饥饿组EPCs的死亡率显著升高（P＜0．01），但这3个时间点之间的死亡率差异无统计学意义(P＞0．05)。在各时间点，0%FBS组和2%FBS组的细胞死亡率无统计学差异（P＞0．05），但是这两组与20%FBS组相比，细胞死亡率的差异具有统计学意义（P＜0．05）。20%FBS组在各时间点的细胞死亡率有统计学差异（P＜0．05）（表2）。

图1 第2代细胞培养3天时的CD31表达（100×，标尺50 μm）Fig.1 CD31 expression in the P2 cultured cells on the 3rdday (100×,bar 50 μm)

图2 第2代细胞培养3天时的CD34表达（100×，标尺50 μm）Fig.2 CD34 expression in the P2 cultured cells on the 3rdday (100×,bar 50 μm)

图3 第2代细胞培养3天时的flk-1表达（100×，标尺50 μm）Fig.3 Flk-1 expression in the P2 cultured cells on the 3rdday(100×,bar 50 μm)

图4 第2代细胞培养3天时的vWF表达（100×，标尺50 μm）Fig.4 vWF expression in the P2 cultured cells on the 3rdday (100×,bar 50 μm)

表1 常氧、低氧环境和不同浓度FBS对EPCs死亡率的影响（x±s）Table 1 The effect of Normal,low oxygen and different FBS concentration on EPCs mortality(x±s)

表2 在低氧环境中，采用不同血清浓度培养不同时间时EPCs死亡率的比较（x±s）Table 2 Comparison of EPCs mortality with different serum concentration and culture time under low oxygen(x±s)

3 讨论

在缺血性心脏病的干细胞移植治疗领域，如何提高移植细胞的生存率一直是个难题。EPCs治疗缺血性心脏病时，需先在常氧（21%O2）、高血清（20% FBS）环境下进行扩增，然后制备细胞悬液用于移植。据报道，移植后1 h内移植细胞的存活率只有58%[7]；而在移植后24 h，只有1%的移植细胞存活[8]，具体原因和机制不明。因缺血性心脏病的基本病理要素是缺氧和缺血[9－10]，我们设想移植细胞的死亡主要与这两种因素有关。

本实验结果显示，在常氧环境中，血清饥饿会明显增加EPCs的死亡率。血清中含有一些生存所需的因子，包括营养物质、生长因子等。以往已经证实，EPCs的培养需要血管内皮生长因子（VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的参与，而血清饥饿组仅含少量或不含有生长因子，影响了EPCs的存活。另一方面，短期低氧对EPCs的死亡率没有明显影响。这可能是因为，骨髓中特别是骨内膜（亦称骨髓膜，为衬垫于骨髓腔内、富含血管的结缔组织层，其结构与骨膜内层相似，也有造骨功能，骨内膜在X线检查中不能显示）中的氧浓度远远低于组织平均氧浓度[11]，造血干细胞对于缺氧环境比较适应。有研究表明，在体外低氧环境中培养造血干细胞，并不影响其自我更新[12]。据此我们认为，与低氧相比，血清饥饿对细胞存活的影响更大。

缺血组织的血管再生是一个长期、缓慢的过程，因此我们还观察了长期低氧对细胞死亡率的影响。结果显示，随低氧时间的延长，血清饥饿组的细胞死亡率急剧上升，72 h即达到96.3%，120 h达100%；20%FBS组的细胞死亡率也有所升高，但是明显低于血清饥饿组。这也证实了血清的细胞保护作用，此外还提示，长期处于低氧环境中，即使有营养因子，细胞存活率也会受到明显影响。

从理论上讲，2%的FBS含有少量营养和生长因子，对干细胞的生存率应该有所帮助[13]。但是，我们观察到，无论在常氧还是低氧环境中，0%FBS和2% FBS组的EPCs死亡率都没有统计学差异。可能对于EPCs来说，2%的FBS提供的营养因子远远不足以满足细胞的生存需要。

总之，血清饥饿和长期缺氧都不利于EPCs的体外生存，其中以血清饥饿的影响更大。在EPCs移植治疗缺血性心脏病时，须注意解除缺血因素，减少局部组织缺氧时间，以提高移植细胞的生存率。

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Effects of Low Oxygen and Serum Deprivation on Death Rate of Endothelial Progenitor Cells

LIAN Feng1,XUE

Song1,GU Ping2,ZHANG Gulan1,WU Xuejun1,ZHU Hongsheng1.1 Department of Cardiothoracic Surgery,Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200127,China;2 Laboratory Diagnostic Center,Shanghai Children's Medical Center,Shanghai 200127,China.Corresponding author:ZHU Hongsheng(E-mail:zhuhs@sohu.com).

Objective To explore the effects of low oxygen and serum deprivation (SD)on death rate of bone marrowderived Endothelial Progenitor Cells(EPCs)．Methods EPCs were isolated from bone marrow of Sprague-Dawley(SD)rats and identified by immunofluorescence assay．Passage 2 EPCs were exposed to normal oxygen(21%O2)and 0%,2%,or 20% fetus bovine serum(FBS)for 48 hours,or low oxygen(3%O2)and 0%,2%,or 20%FBS for 48,72,96,and 120 hours．Cell death rate was calculated by Live/Dead staining and image analysis．Results Cell death rate was not affected by low oxygen for 48 hours(P＞0．05),but affected greatly by serum deprivation(P＜0．01)．In a low-oxygen environment for longer hours,cells exposed to serum deprivation(0%,2%FBS)showed much higher death rate,as compared with cells exposed to 20%FBS (P＜0．01)．The death rate reached (96．30±3．18)%for 72 hours and 100%for 120 hours．Conclusion Survival of EPCs is affected by both low oxygen and serum deprivation,of which serum deprivation plays a more dominant role．

Endothelial progenitor cells; Serum deprivation; Low oxygen; Death rate

Q813．1＋2

A

1673-0364（2011）04-0181-05

2011年6月14日；

2011年7月7日）

10．3969/j．issn．1673-0364．2011．05．001

国家自然科学基金（30170930），上海市自然科学基金（044119715，08ZR1413600）。

200127 上海市 上海交通大学医学院附属仁济医院心胸外科（连锋，薛松， 张谷兰，吴学军，朱洪生）；200127 上海市 上海儿童医学中心实验诊断中心（顾萍）。

朱洪生（E-mail：zhuhs@sohu．com）