王 健 刘 霞 肖 苒 曹谊林

·论著·

应用细胞膜片复合硅胶管内支撑构建组织工程管状软骨

王 健 刘 霞 肖 苒 曹谊林

目的 研究利用羊耳软骨细胞形成细胞膜片，构建无细胞支架组织工程管状软骨的可行性。方法 体外培养扩增羊耳软骨细胞至第2代，以2.0×106cells/mL的高密度，培养7 d，形成直径为35 mm的圆形细胞膜片，将细胞膜片均匀包裹于硅胶管，植入裸鼠背部皮下，4周后取材检测。以大体观察、组织学、免疫组织化学等方法，对形成的软骨进行评价。结果 大体观察可见形成良好的管状软骨，HE染色见软骨陷窝形态规则，番红O染色及Ⅱ型胶原免疫组化均呈阳性表达。结论 细胞膜片复合硅胶管内支撑的方法能形成管状软骨，为气管软骨的再造提供了新的方法。

无细胞支架 细胞膜片 管状软骨 气管软骨

因肿瘤、外伤、先天畸形等导致的气管缺损，临床上至今没有理想的修复方法。目前，修复气管缺损常用的手段是端端吻合。但缺损过长时，需采用自体移植[1-3]、异体移植[4]、人工材料[5－6]等方法进行修复，这些方法均存在不同的局限性。软骨组织工程技术的研究进展，为气管构建及修复提供了新思路[7－8]。

以往的研究多采用软骨细胞接种支架材料 （如PGA等），在动物体内构建环状或管状软骨[7，9]。但支架材料降解时间长，需要在体外培养较长时间，未完全降解的支架材料容易引起炎症反应，从而影响特定形状的组织工程化软骨的形成[9-12]。因此，我们尝试单纯应用细胞膜片，不用细胞支架的方式构建管状软骨，以避免材料降解产物对软骨形成的不良影响，并缩短体外培养时间。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康山羊3只，6月龄，体质量25 Kg，雌雄不限（中国医学科学院整形外科医院动物中心）。

1.2 羊耳软骨细胞分离、培养与扩增

取羊耳软骨，将其剪成2 mm×2 mm×2 mm大小，PBS冲洗3遍，以0．25%胰蛋白酶（含EDTA）在37℃摇床中预消化30 min，以消除软骨表面残余软组织。PBS冲洗3遍，以4倍体积的0．2%Ⅱ型胶原酶37℃摇床内消化10～12 h，200目滤网过滤，2 000 r/min离心8 min，去上清后加入含有10%FBS的DMEM培养液重悬，计数后以1×104cells/cm2的细胞浓度接种培养皿，在37℃、5%CO2、100%饱和湿度的培养箱内培养。每3天更换一次培养液。待细胞生长近80%汇合后，以0．25%胰蛋白酶（含EDTA）消化并传代培养，仍以1×104cells/cm2细胞密度传代，传至第2代，收集备用（图1A）。

1.3 羊耳软骨细胞培养形成细胞膜片

将收集的羊耳软骨细胞以2×106cells/mL密度接种于直径35 mm的培养皿，用含10%FBS的DMEM培养基培养，每天换液，7 d后薄膜状细胞膜片形成（图1B）。

1.4 细胞膜片包裹于硅胶管外构建管状复合体

内支撑的硅胶管长1 cm，外径8 mm，管壁打孔，高压消毒后备用（图1C）。然后将体外构建的细胞膜片包裹于硅胶管外，形成管状复合体（图2A）。

1.5 植入、取材及相关检测

将管状复合体植入裸鼠皮下培养4周后取材，行大体标本观察，并以4%多聚甲醛固定24 h、脱水、石蜡包埋、切片，HE染色、番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组化进行组织学观察。

2 结果

2.1 细胞形态及细胞膜片观察

原代软骨细胞接种12～24 h后贴壁，由圆形逐渐伸展呈椭圆形、三角形和多角形，形成独立的同源细胞群，随后细胞群落逐渐扩展汇合。传代后，软骨细胞大多呈多角形或梭形，一般5～7 d可达80%以上汇合。

第2代软骨细胞经高密度接种培养1周后，形成具有一定厚度的细胞膜片，呈乳白半透明状，有光泽和弹性，可以用镊子简单地夹起，并折叠和卷曲，可操作性良好。

2.2 大体及组织学观察结果

将细胞膜片包裹于硅胶管后，植入裸鼠皮下培养4周，取材时可见管状软骨样组织形成（图2B），长度1 cm，直径8 mm，颜色呈乳白色，有光泽，质地均匀、中等偏硬，弹性好，能够维持管状外形，触之不会塌陷，可以用器械夹持操作。HE染色可见软骨样细胞均匀分布，呈卵圆形，偶见多角形，陷窝结构清晰，细胞位于陷窝之中，周围是较均匀的细胞外基质；番红O染色可见细胞外基质着色为鲜红色，提示GAG聚合蛋白多糖含量丰富，有大量软骨基质物产生；Ⅱ型胶原免疫组化结果阳性，提示有丰富的胶原沉积（图3）。

图1 细胞膜片及植入体构建Fig.1 Chondrocyte sheet and implant

图2 细胞膜片包裹硅胶管体内构建管状软骨Fig.2 Construction of cylindrical cartilage combined with cell sheet and silicon tube

图3 组织学检测（100×）Fig.3 Histological observation(100×)

3 讨论

组织工程管状软骨的构建策略多为先将支架材料预制成管状，再将细胞悬液接种到多孔的支架材料上，并在动物体内形成软骨。但是，应用支架材料主要存在两个问题，一是细胞接种效率比较低，由于液体的流动性，很多细胞在接种时容易丢失，细胞分布也不均匀，这对构建特定形态的组织是不利的[13]；二是植入机体后容易引起炎性反应，生物相容性好且可降解的支架材料，在构建特定形态、体积较大的软骨时，常存在强度差、降解速度太快、降解产物影响细胞生长等问题，机体对材料的免疫排斥反应也影响着软骨组织的形成[14]。

本实验中，我们采用细胞膜片的方式防止细胞流失，提高细胞利用率，而且避免了材料降解产物对组织形成的影响。所形成的膜片其内部细胞分布均匀，细胞被自身分泌的基质相互连接为整体，类似软骨组织。我们进一步以硅胶管作为内支撑，将膜片包裹后直接植入裸鼠皮下，减少了体外培养时间，而且避免了支架材料引起的免疫反应，构建出管状软骨组织。所形成组织质地均匀，形态维持好，具有一定弹性，证实我们采用的无细胞支架的细胞膜片技术，在体内构建具有精确形态和良好机械强度的管状软骨移植体是完全可行的。本实验所采用的这种构建方法，也为其他特定形态组织的构建提供了方法学参考。

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《组织工程与重建外科》杂志2012年征稿、征订通知

《组织工程与重建外科》杂志（Journal of Tissue Engineering and Reconstructive Surgery)是由上海交通大学主管、上海交通大学医学院附属第九人民医院主办的综合性医学学术期刊，国内统一连续出版物号：CN 31-1946/R，标准刊号：ISSN 1673-0364。

本刊由中国工程院院士张涤生教授担任名誉主编，中华医学会整形外科分会主任委员、中国生物医学工程学会组织工程分会主任委员曹谊林教授担任主编。本刊是组织工程学和整形重建外科的专业学术期刊，报道组织工程及其相关领域、美容外科、颅面外科、眼科、口腔颌面外科、四肢显微外科、骨科的临床及基础研究成果，并及时介绍整形重建外科重大进展、新技术和新动态，力求科学性、实用性。本编辑部诚征上述相关研究领域文章，欢迎各位专家、学者赐稿。欢迎广大医务人员、科研工作者、相关研究院所、医院图书馆、高等院校图书馆订阅。

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《组织工程与重建外科》杂志编辑部

Construction of Scaffold-free Cylindrical Cartilage Combined with Cell Sheet and Silicon Tube

WANG Jian,LIU Xia,XIAO Ran,CAO Yilin.Research Center of Plastic Surgery Hospital,Peking Union Medical College,Chinese Academy of Medical Science,Beijing 100144,China.Corresponding author:LIU Xia(E-mail:Lacey2003@tom.com),Cao Yilin(E-mail: yilincao@yahoo.com).

Objective To explore the feasibility of fabricating a scaffold-free cylindrical cartilage using cell sheet with silicon tube as interior support in vivo.Methods Auricular chondrocytes were harvested from goat and the second passage of auricular chondrocytes were cultivated with high-density of 2.0×106cells/mL to form a chondrocyte sheet with the diameter of 35 mm.Then the silicon tube covered with cell sheet was implanted into the back of nude mice.The tissue engineered cylindrical cartilages were evaluated by gross observation,histological and immunohistochemical examination.Results The cartilage was sufficiently elastic and stiff to maintain the structure without disruption. Cartilage tissue was observed by HE staining,Safranin O staining and immunohistochemical staining for typeⅡ collagen.Conclusion A novel technique was developed for fabricating engineered cylindrical cartilage using cell sheet with silicon tube in vivo.

Scaffold-free;Cell sheet;Cylindrical cartilage;Tracheal cartilage

Q813.1+2

A

1673－0364（2011）04－0181－05

2011年8月3日；

2011年8月25日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.05.001

北京市科委科技计划重大项目资助（D090800046609003），卫生部部属医院临床学科重点项目,国家自然科学基金青年科学基金项目 （30801192），北京市自然科学基金（7102134），高等学校博士学科点专项科研基金（新教师基金课题，200800231078）。

100144 北京市 北京协和医学院，中国医学科学院整形外科医院研究中心。

曹谊林（E-mail:yilincao@yahoo.com），刘霞（E-mail: Lacey2003@tom.com）。