安 倩 张萍萍 李明浩 陈于和 吴丽芳

1(河北科技师范学院 秦皇岛 063000)

2(中国科学院离子束生物工程学重点实验室 合肥 230031)

据美国能源部和世界能源理事会预测，全球石化类能源的可开采年限分别为石油 39年、天然气60年、煤211年[1,2]，到21世纪中叶化石燃料将被开采殆尽，或因开采成本过高而失去开采价值。为应对世界范围的能源危机，开发和利用可再生新能源成为各国的战略举措。其中，生物能源备受关注。

国外研究较多的生物柴油木本植物是麻风树，但其只适合生长于我国少数地区[3,4]。黄连木(Pistacia chinensis Bunge)又称楷木、药木、黄连茶等，属漆树科(Family anacardiaceae)黄连木属(Pistacia chinensis)，是多年生木本油料植物。黄连木的特点为：

(1) 用途广泛，可用作生产肥皂、润滑油、染料粘合剂、工程塑料等的工业原料；

(2)分布范围广，野生和栽培于华北、华南及华中23个省区；

(3) 适应性强，耐干旱、盐碱、瘠薄，可在荒山荒地种植，宜于大面积造林；

(4)含油率高，果实含油率～35%、果肉含油率～50%、种子含油率42%、种仁含油率56%[5]。以黄连木种子为原料生产的生物柴油，主要理化指标达美国生物燃料油标准和中国轻质燃料油标准S6T[6]。黄连木是我国极具开发前景的生物质液体燃料树种，属优先发展的木本能源树种之一[7–10]。

黄连木油脂转化生物柴油技术，是我国唯一通过国家鉴定[国经贸鉴字(2002)046号]的木本生物质柴油生产技术。然而，大规模开发利用取决于种质资源，要获得高产、高品质、童期短、抗病虫的黄连木种子，关键在育种。常规育种技术是通过基因重组、累加、互补等遗传效应获得新类型，既保持原品种的优良性状，又弱化原品种的不良性状。其整体水平提高幅度大，但有遗传稳定性差、育种周期长的缺点。辐射诱变育种是继实生选种和杂交育种后发展的育种方法，可大大提高基因突变频率，缩短育种周期，改良品质而又不改变原品种的优质性状，可获得常规育种难以奏效的新种质[11]。

目前，黄连木多处于野生状态，基础研究较为薄弱，且大多集中于引种栽培、播种繁殖、病虫害防治、资源调查等方面。用辐射手段获得黄连木新种质，加快黄连木遗传改良的步伐，此类研究尚未见报道。本文将黄连木种子进行不同剂量的钴60g射线辐照，由萌发率、苗高、成苗率、形态及RAPD分析法研究处理植株的变异，获得的初步结果，可为辐射法获取黄连木优良种质提供借鉴。

1 材料和方法

1.1 黄连木种子及其辐照

黄连木种子干种子取自安徽省东至山区。在安徽省农科院原子能所进行60Co g射线辐照，剂量率为 14Gy/min，剂量分别为 100、200、400、600、800Gy，以未辐照种子作对照。

1.2 种子萌发

辐照处理种子及对照种子用70%乙醇处理1.25 min，用0.1%氯化汞处理15 min，无菌水冲洗后置于垫有 Φ9cm 培养皿中(垫有三层滤纸)，加入 12 mL蒸馏水。每组100粒，重复3次。加盖后25°C恒温黑暗培养。种子以胚根明显露白为发芽，统计第3、7、10天发芽种子数[12]。14天后，将幼苗转移到装有营养土的盆钵中培养 6周左右后移栽大田，移栽前测量并记录苗高。6个月后，统计成苗率，观察并统计植株变异情况（此时可观察到稳定的植株变异性状）。

1.3 基因组DNA提取

主要试剂：CTAB提取缓冲液：3% CTAB(CTAB购自Bio Basic INC)，100 mmol/L Tris-HCl(Tris购自Bio Basic INC)，50 mmol/L EDTA（国药试剂），1.4 mol/L NaCl，3%b-巯基乙醇，3% PVP，pH=8.0；氯仿-异戊醇(24:1)；5 mol/L KAc，RNA酶（上海生工）10 mg/mL。

用于DNA提取的样品取自6个月以上的植株，在每个处理剂量与对照组中随机取12个植株，取幼嫩叶片提取DNA。基因组DNA的提取用CTAB法，参考程世平等[13–15]提取方法并稍加改进。

1.4 RAPD反应

以对照和不同处理剂量的植株 DNA为模板，用RAPD随机引物进行PCR扩增，反应在Applied Biosystems Thermal Cycler上进行。采用上海生工S系列引物，从28个引物中筛选19个可用引物进行RAPD 分析(表 1)。反应体系为 20 mL：10´buffer，2.0 mL；200 mmol/L dNTP，0.2 mmol/L 引物，1.0 UTaq酶，模板DNA约40 ng。PCR扩增程序为：94°C 预变性 2 min，94°C 变性45 s，36℃退火 1 min，72°C 延伸 2 min，45 个循环后，72°C 延伸 5 min，4°C保存[16,17]。扩增产物经 1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统照相分析。每个反应重复多次，以多次重复中稳定出现的亮带作为统计对象[18,19]。

表1 RAPD分析引物及其序列Table 1 The sequence of primers used for RAPD analysis

2 结果

2.1 60Co g射线辐照对种子萌发的影响

60Co g射线辐照引起黄连木种子发芽率的降低较对照差异很明显，与剂量负相关，即随剂量增大，发芽率逐渐降低(图1)。

2.2 60Co g射线辐照生物学效应分析

辐射剂量对成苗率的影响见表 2，成苗率随辐射剂量升高而降低。100Gy和200Gy剂量处理的植株成苗率分别为23.75%、20%，而对照组成苗率为 30%，差异显著；400、600、800Gy剂量处理的植株成苗率分别为1.75%、0.25%、0，彼此间差异不显著，但与对照差异显著。

图1 钴60g射线辐照黄连木种子萌发的影响Fig.1 Effect of 60Co g-ray irradiation on germination of Pistacia chinensis Bunge seeds.

表2 60Co g射线辐照黄连木种子对幼苗生长的影响Table 2 Effect of 60Co g-ray irradiation on seedling growth of Pistacia chinensis Bunge seeds

辐照200和400 Gy的种子的7日发芽率分别为33%和 32%，几乎相同，但成苗率分别为 20%和1.75%，差异极显著。辐照600和 800Gy种子的10日发芽率在20%左右，但成苗率几乎为零。生长速率也随剂量增大而减小。在7天时，对照小苗平均根长3cm左右，而800Gy小苗平均根长仅1cm左右（结果未显示）。辐射损伤对苗高的影响(表2)也有同样趋势。100Gy处理组苗高平均为9.2 cm，对照组为9.7 cm，差异不显著； 200和400Gy处理组苗高平均为4.0和2.3 cm，与对照组有显著差异。

与对照相比，各辐照处理组的黄连木幼苗出现矮化、株型不对称、叶脉失绿、叶片卷曲、畸形等现象(图2)。成苗率较高的两个处理组在幼苗期出现的变异类型的统计结果见表3，200Gy组的叶形变异率为48.8%，株型变异率为46.3%，明显高于100Gy组的33.8%和15.0%，说明200Gy辐照对黄连木幼苗产生较大影响。对幼苗突变性状进行的跟踪观察发现，幼苗期出现的有些变异性状很可能是一种短期的生理效应，2个月后大部分变异性状开始消失。但仍有少数变异保持到6个月后(图3)，这样的变异应是可遗传的。为此，对6个月大的处理材料作了RAPD 分析，以研究其DNA水平的变异。

图2 60Co g射线辐照后黄连木幼苗变异(A)左，对照；右，处理后的矮化幼苗 (B,C) 叶形变异幼苗 (D)对照 (E, F) 株型变异幼苗Fig 2 Seedling variation of Pistacia chinensis Bunge seeds irradiated by 60Co g-rays.(A) the control in the left and the dwarfed plant in the right, (B,C) the leaf variation, (D) the control, (E,F) the type variation

表3 钴60g射线辐照黄连木种子对幼苗变异的影响Table3 Effect of 60Co g-ray irradiation on seedling variation of Pistacia chinensis Bunge seeds.

图3 六个月植株变异情况(G)株高对照，(H)和(I)处理后的矮化植株；(J)叶形和株型对照，(K)和(L)叶形变异，(M)株型变异Fig 3 Variations of the 6-month plants.(G) the control, (H,I), the dwarfed plant; (J) the control, (K,L) the leaf variation, (M) the type variations

2.3 黄连木基因组DNA提取

黄连木叶片富含单宁等次生代谢物质，造成DNA提取困难。我们改进了DNA提取方法，获得了纯度较高且较为完整的大分子DNA(图4)。

2.4 RAPD结果

在所使用的28个引物中，有19条引物有扩增产物，扩增条带数从0-10条不等。与对照组(未发现差异)相比，辐照组有条带的增加或缺失，且差异出现的频率与剂量有关：100Gy组有 5株检测到RAPD差异，每株变异情况不完全一样，共记录到20个条带增加，16个条带缺失，植株变异率为41.7%，条带变异率为2.23%；200Gy组有7株检测到RAPD差异，其中条带增加43条次，缺失32条次，植株变异率为58.3%，RAPD条带变异率为4.63%(见表4)。图5和图6是用RAPD引物S17和S82扩增出的RAPD条带差异。

图4 黄连木基因组DNA提取结果(M: lDNAHindIII)Fig4 Extraction results of genome DNA of Pistacia chinensis Bunge (M: lDNAHindIII).

表4 钴60g射线辐照与RAPD条带变异率的关系Table4 RAPD fragment bands variation of the 6-month plants grown from the seeds irradiated to 100 and 200 Gy.

图5 引物S17扩增结果M：marker-G；1–3为对照，5–9为200Gy剂量处理6和7中各出现一条不见于对照的条带(箭头所示)Fig 5 RAPD bands patterns of S17.M: marker-G; No.1–3, the controls, No.5–9, 200Gy treatment.No.6 and.7 have a band which does not appear in the controls,as indicated by the arrows.

图6 引物S82扩增结果M, marker-G；1–3, 对照;4–10, 100Gy 9和10中均缺失一条对照有的条带(箭头所示)Fig 6 RAPD bands patterns of S82.M, marker-G; No.1–3, control; No.4–10, 100 Gy treatment.A band in the control is not found in No.9 and 10, as indicated by the arrow.

3 讨论

辐射育种一般采用半致死剂量辐照后种子发芽率为50%的剂量作为适宜剂量。其他可采用的指标还包括种子发芽率、植株成活率、生长抑制程度等。本研究的对照及各辐照处理组的发芽率和成苗率均未达到50%，显然不能用半致死剂量。育种者也常以半致矮量(辐照后植株生长受抑制的程度)作为诱变剂量是否适宜的标准[20]。本实验中，200 Gy就可使黄连木幼苗高度降低到对照的一半，也即半致矮剂量接近200 Gy。况且，200 Gy组100 Gy组能得到更多的株型和叶形变异，也比400 Gy组有更高的成苗率。因此，200Gy是较合适的诱变剂量。这一点在RAPD分析中也得到证实，200 Gy组的植株变异率及条带变异率都明显高于100 Gy。有研究表明，小油桐种子的最佳辐照剂量为132–198 Gy[21]，而毛竹种子为 100–175 Gy[22]，与本实验的结论相近。

黄连木种子外被蜡质，属深度休眠类型，不能直接发芽，须经过100天左右的低温(4ºC)湿（砂）藏处理才能萌发。我们在试验中发现，去除种壳可打破黄连木种子休眠，故发芽试验的种子去除种壳。60Co g射线辐照处理后黄连木种子萌发率随剂量增加而下降，表明g射线辐照对种子的生活力有明显的影响。王兆玉等[21]在研究小油桐种子的60Co g射线辐射效应时，也得到了相似的结果。

60Co g射线辐照处理的黄连木种子，其成苗率及苗高均低于对照，且随辐照剂量增加而减小，600和800Gy组的成苗率几乎为零。用400Gy以上的辐照处理会对黄连木种子造成较严重的损伤，严重影响其发芽、成苗、生长，甚至致死。蔡春菊等[22]研究60Co g射线辐射对毛竹早期幼苗生长的影响时，剂量超过100Gy，早期苗高和根生长受到明显抑制，抑制作用随辐照剂量增大，与本实验的结果相似。

用RAPD方法对植株总DNA进行分析，不受表达产物显隐性影响，也不像同工酶等易受环境条件的影响，DNA水平发生的碱基突变、序列重排、缺失等引起的变异皆可检测到。本实验结果表明了60Co g射线辐照导致黄连木在生理生化水平和遗传水平的变异，且变异率随剂量增大，200Gy组的诱变效果较为理想。本实验经60Co g射线辐照得到的突变体，其变异性状能否稳定遗传，有待进一步观察和鉴定。

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