宋 英 宋 崎 周小初 王建新

（1.复旦大学药学院，上海 201203；2.上海开拓者医药发展有限公司，上海 201203；3.上海市中药研究所，上海201240）

贯叶金丝桃（Hypericum perforatum L.）是藤黄科金丝桃属植物，在欧洲具有悠久的抗抑郁临床应用历史。近年来对贯叶金丝桃的药理研究发现，它还具有抗肿瘤、抗菌、抗艾滋病毒、抗乙肝病毒等多方面的药理活性[1]。贯叶金丝桃及其提取物是近年来欧美最畅销的植物药之一。研究表明，贯叶金丝桃的主要化学成分包括（1）苯并二蒽酮类，如金丝桃素、伪金丝桃素等；（2） 黄酮类化合物，包括槲皮素、金丝桃甙、芦丁、阿曼托黄素等；（3）间苯三酚类，如贯叶金丝桃素、加贯叶金丝桃素等；（4） 其他成分，包括挥发油类、香豆素类、原花青素等[2]。

国内具有丰富的贯叶金丝桃资源，但目前基本上是经过粗加工制成提取物后出口，尚未有贯叶金丝桃的药物制剂被批准上市。因此，笔者将贯叶金丝桃提取纯化后，开发有效部位制剂解郁舒心片，并对制剂中金丝桃素类化合物、黄酮类化合物和贯叶金丝桃素的含量进行了控制。其中，黄酮类化合物最高，而且具有一定的抗抑郁活性[3]，本研究对其测定方法HPLC和UV法进行研究。

1 仪器与试药

Agilent HP1100高效液相色谱仪，Agilent 110MWD检测器；日本岛津UV-2401pc紫外可见分光光度计。

金丝桃苷对照品、芦丁对照品均由国家药品生物制品检定所提供；解郁舒心片（自制，批号：20090213、20090215、20090220）。

2 方法与结果

2.1 总黄酮的UV法测定

2.1.1 测定波长的选择 样品溶液经波长扫描，最大吸收波长在（420±2）nm处，与芦丁对照品一致。空白试剂经扫描在(420±2）nm处无吸收，因此选择420nm为总黄酮测定波长。

2.1.2 样品溶液的制备 取本品20片，精密称定，除去包衣，研细，取约0.1g，精密称定，置50mL量瓶中，加70%乙醇40mL超声处理（功率350W，频率35kHz）15min，放冷，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，取上清液，用0.45µm滤膜过滤，取续滤液5mL，置25mL量瓶中，用70%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得样品溶液。

2.1.3 线性关系考察 精密称取五氧化二磷减压干燥24h的芦丁对照品，用70%乙醇配制成1mL含芦丁0.5mg的溶液，分别精密量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于25mL的量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，摇匀，分别精密量取各不同浓度对照品溶液5mL，加0.1mol/L三氯化铝溶液3mL和1mol/L醋酸钾溶液5mL，使混匀，放置40min，以试剂为空白，在420nm波长处测定吸收度（A），以浓度（C）为横坐标，A为纵坐标，进行回归，得标准曲线方程为：C=40.1644 A+0.0370，r=0.9999，表明在7.5～45.3µg/mL范围内总黄酮浓度与吸收度呈良好的线性关系。

2.1.4 精密度试验 取同一对照品溶液（93.56µg/mL），连续测试5次，总黄酮含量的RSD为0.103%，表明本方法精密度良好。

2.1.5 重现性试验 分别取同一批样品五份，按2.1.2 测定，结果表明重现性良好，总黄酮平均含量为32.22%，RSD 1.79%。

2.1.6 样品溶液稳定性试验 按2.1.2制备样品溶液，放置0、1、2、4、6、8、12、24h各测1次，RSD 0.7%，表明样品溶液中黄酮含量在24h内稳定。

2.1.7 回收率试验 采用加样回收法，在已知含量样品中加入定量芦丁对照品，按2.1.2 制备样品溶液，240nm处测定吸收度，计算回收率，平均回收率为100.36%，RSD为2.58%。见表1。

表1 回收率试验结果

2.1.8 样品测定 按2.1.2项对3批样品进行测定。见表2。

表2 3批样品总黄酮含量测定结果

2.2 金丝桃苷和芦丁的HPLC法测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱 shim-pack CLC-ODS（6.0mm ID×15cm）；水-乙腈-磷酸（825︰175︰1）为流动相；检测波长为368nm;流速：1m L/m in。理论板数按金丝桃苷和芦丁峰计算应不低于3000。在此条件下，金丝桃苷和芦丁均可以与相邻色谱峰达到基线分离，分离度大于1.5。色谱图见图1。

图1 样品溶液的色谱图

2.2.2 样品溶液的制备 取本品20片，精密称定，除去包衣，研细，取约0.1g，精密称定，置50mL量瓶中，加70%乙醇40mL超声处理（功率350W，频率35kHz）15min，放冷，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，取上清液，用0.45µm滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液，进样测定。

2.2.3 线性关系考察 分别精密称取五氧化二磷减压干燥24h的芦丁、金丝桃苷对照品用70%乙醇分别配制成每1mL含芦丁0.5mg、每1m L含金丝桃苷 0.06mg的溶液，各精密量取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0m L于10m L量瓶中，分别用70%乙醇定容至刻度，摇匀，各进样10µL，测定芦丁、金丝桃苷峰面积。以进样量C对峰面积A进行回归，得标准曲线方程分别为：芦丁C=0.02635+7.155×10-7A，r=0.9998，表明在0.45～4.50µg范围内芦丁的进样量与峰面积具有良好的线性关系。金丝桃苷C=8.218×10-3+4.783×10-7A，r=0.9999，表明在0.06～0.60µg范围内金丝桃苷的进样量与峰面积具有良好的线性关系。

2.2.4 精密度试验 精密吸取含芦丁和金丝桃苷的对照品溶液10µL，连续重复进样5次，结果芦丁和金丝桃苷含量的RSD分别为0.36%与0.29%，表明本方法精密度良好。

2.2.5 重现性试验 分别精密称取同批样品5份，按2.2.2测定，结果表明重现性良好，芦丁平均含量为5.67%，RSD 0.63%；金丝桃苷平均含量为3.07%，RSD 0.84%。

2.2.6 样品溶液稳定性试验 按2.2.2制备样品溶液，放置0、1、2、4、6、8、12、24h各测1次，峰面积稳定，RSD 为0.61%，0.50%，表明24h内样品溶液中芦丁和金丝桃苷的含量稳定。

2.2.7 回收率试验 采用加样回收法，在已知含量样品中加入定量对照品，进行测定，结果见表3。

2.2.8 样品测定 按2.2.2对3批样品进行测定，结果见表4。

表3 回收率试验结果

表4 3批样品中芦丁和金丝桃苷的含量测定结果（%）

3 讨论

3.1 显色方法的选择

在进行UV法测定总黄酮的测试方法研究中，曾采用亚硝酸钠与硝酸铝溶液显色法[4]，样品溶液测试结果极不稳定，30m in吸收度下降30%，故未采用。本测定条件主要参考资料[5]，采用三氯化铝与醋酸钾溶液显色40m in，结果稳定。

3.2 提取分离条件的确定

根据文献报道[6]，芦丁、金丝桃苷均易溶于甲醇或乙醇，将样品分别加甲醇或70%乙醇超声30min，均全部溶解，分别测定含量，再将样品加70%乙醇分别用不同超声时间处理。由试验结果可知，以甲醇或70%乙醇为溶剂，提取结果差异无统计学意义，考虑到甲醇毒性较大，故采用70%乙醇提取。不同超声时间比较结果表明，超声15min与超声30、45、60min差异无统计学意义，故确定以70%乙醇超声处理15min为最佳提取条件。

3.3 UV法和HPLC法结合应用控制含量

本研究中UV法测定的是总黄酮的含量，主要包括金丝桃甙、芦丁、槲皮素、阿曼托黄素等，其含量以芦丁计算。通过UV法和HPLC法的结合应用，可以对解郁舒心片中总黄酮和主要的黄酮类成分金丝桃甙与芦丁的含量进行较好的控制，从而更好的保证产品的质量。

[1] Jeffrey MG，Britt S，Daniel AM.St John’s wort（Hypericum perforatum）：a review of the current pharmacological，toxicological，and clinical literature[J].Psychopharmacology，2001，153（2）：402.

[2] 刘一兵.贯叶金丝桃研究进展Ⅰ-原植物、采收、制剂和化学成分[J].国外医药：植物药分册，1998，13（3）：99.

[3] 张庆建，赵毅民，杨明.黄酮类化合物对中枢神经系统的作用[J].中国中药杂志，2001，26（8）：511-514.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典·一部[S].北京：化学工业出版社，2000：292.

[5] 陈奎发.常用中草药有效成分含量测定[M].北京：人民卫生出版社，1997：12.

[6] 国家医药管理局中草药情报站.植物药有效成分手册[M].北京：人民卫生出版社，1986：597，902.