林飞燕,陆 春

(中山大学第三附属医院皮肤病与性病科,广东广州 510630)

生物被膜(Biofilm,BF)是微生物在生长过程中附着于物体表面而形成的由微生物的细胞及其分泌的聚合物等所组成的膜样多细胞复合体,多项研究表明生物被膜的形成可以增强微生物对环境和抗生素的耐受性,目前生物被膜的形成被认为是微生物耐药尤其是多重耐药的机制之一[1]。在耐药机制的研究中,微生物的耐药性通常由某耐药基因或基因突变的编码产物所介导,相对而言生物被膜形成介导的耐药机制则十分复杂。目前研究发现,耐药基因尤其是药物外排泵编码基因和生物被膜在微生物耐药机制中有着复杂而密切的关系:生物被膜初步开始形成后,菌株基因表达即开始发生变化以适应新的生长环境,这种变化由独特的基因表达模式所控制,称为生物被膜表型,生物被膜内环境对多种基因表型具有特殊的调控作用;在生物被膜形成过程中,某些耐药基因及其产物可能在影响生物被膜形成、增强生物被膜耐药性、协助生物被膜内部信号传导以及调控生物被膜毒力、活性等多方面发挥不同作用。本文分别从生物被膜对药物外排泵、耐药基因的影响,药物外排泵对生物被膜的影响,以及药物外排泵和微生物生物被膜共同的调节因素等方面,对近年来的相关研究进展作一综述。

1 生物被膜对药物外排泵、耐药基因的影响

1.1 生物被膜的内环境特点及其与药物外排泵的关系

生物被膜中的营养成分和氧浓度自外向内呈梯度下降,代谢产物浓度、渗透压则逐渐上升,生长环境的差异使生物被膜外层与内层微生物体积大小和代谢活性存在显著差异,内层的微生物生长状态较外层微生物缓慢也称饥饿状态;目前大多数抗生素均是针对生长期的微生物,当使用抗菌药物治疗时,生长快速的生物被膜外层或表层微生物最敏感,首先被杀死,而大多数抗生素都不能很好地杀灭生长缓慢或停滞的处于饥饿状态的微生物,这是生物被膜耐受抗菌药物和持续存在的重要机制之一[1]。也有研究指出生物膜菌株和游离菌株即使生长速度相同,耐药水平依然差异很大:铜绿假单胞菌的游离株和膜内株对妥布霉素和环丙沙星的敏感性随生长速度的加快而增加,但在较高的生长速度下,浮游菌比膜内细菌对环丙沙星更敏感[2]。与此同时,生物被膜深层微生物累积的高浓度代谢产物还可以增强外排泵的作用,如大肠埃希菌生物被膜中的代谢产物可诱导AcrAB-TolC外排泵对萘啶酮酸泵出作用增强,而某些药物外排泵(主要为多药耐药外排泵)不仅仅以抗菌药物为底物,还可以将微生物的代谢产物、毒性物质、酶类、致病因子等排出胞外,这可能有助于生物被膜内饥饿状态微生物维持其活力与毒力[3]。

1.2 生物被膜中耐药基因的表达及对耐药性的影响

目前对生物被膜中相关耐药基因的转录、翻译水平的定量监测,是生物被膜耐药机制研究的一大热点。在生物被膜形成过程中,耐药基因表达的上调有助于生物被膜对抗菌药物抵抗力的增强,其中排泵基因的影响最为显著:在白色念珠菌生物被膜形成过程中,表面可结合氮杂茂的受体数目与悬浮生长时相近,但氮杂茂外排泵的编码基因CDR的表达水平比悬浮生长时上调,提示外排泵基因的高度表达对白色念珠菌生物被膜的抗药性产生有一定作用[4]。在铜绿假单胞菌生物被膜的耐药机制中,有研究证实其对阿奇霉素和对妥布霉素的耐药性分别是由MexCD-OprJ外排泵和MexXY-Op rM外排泵高表达所致[5-6],而PA1874-1877编码的外排系统对于铜绿假单胞菌生物被膜多重耐药(耐受妥布霉素、庆大霉素、环丙沙星)具有重要作用[7]。但耐药基因高表达并不意味着耐药性必然升高,有研究发现尽管铜绿假单胞菌生物被膜中MexAB-Op rM外排系统也存在过度表达,却并未对β-内酰胺类抗生素显示出耐药性增强[8]。生物被膜耐药性对药物外排泵的依赖性并非始终如一,如铜绿假单胞菌生物被膜MexAB-Op rM基因的表达水平,只能影响其对低剂量氧氟沙星的耐药性[9]。另外,耐药基因在生物被膜形成的不同时期其表达水平也并不一致:白假丝酵母菌生物被膜的成熟程度与耐药性增强有明显正相关性,有研究发现外排泵编码基因CDR1、CDR2和MDR1在白念珠菌生物被膜形成的早期(<12 h)表达增多,可能参与耐药,但在成熟期(>12 h)以上3种基因缺失的菌株也达到了与携带耐药基因的菌株相同的耐药水平[10];也有研究指出,与早期生物被膜相比,白色念珠菌成熟生物被膜菌株的药物流出泵基因CDR1表达上调,表达水平改变活跃,而MDR1基因的表达在生物被膜的整个成熟过程中基本维持不变[11]。此外,耐药基因表达并非一味增强,出现上调或下降均有可能,有研究发现大肠埃希菌的某突变体虽然可以形成正常的生物被膜结构,但形成过程中包括编码多药外排泵的wasyhcQ基因在内的22种基因均出现了表达下调[12]。

1.3 生物被膜中的基因突变和表型改变

生物被膜内微生物突变频率明显高于浮游状态的微生物,这意味着高突变微生物亚群的存在,突变结果对生物被膜中微生物的耐药性、黏附力、致病力等多种生物学特性的增强具有重要作用[13],例如铜绿假单胞菌菌株对环丙沙星的耐药性被证明是由gyrA基因和2个外排系统(Mex-CD-OprJ和MexEF-Opr N)的突变导致[14];表皮葡萄球菌的luxS突变株形成生物被膜的能力增强,且在大鼠模型中生物被膜感染加重[15]。生物被膜中氧化压力的不平衡导致微生物出现氧化应激,被认为是引起生物被膜内基因突变的重要原因[16]。生物被膜形成后某些基因可出现明显的表型改变,从mRNA水平和蛋白水平都和游离状态的微生物存在很大区别,如大肠埃希菌生物被膜有10%基因表达明显不同于浮游细菌,其中1.9%基因表达活性上调或下调2倍以上[17]。

1.4 生物被膜促进细菌间耐药基因的水平转移

由于生物被膜内微生物彼此密切接触,菌体间基因的水平转移更加容易,整合酶的整合功能更活跃,整合子在生物被膜状态下也可进行更活跃的基因捕获[18],因而生物被膜内微生物基因和表型更容易复杂化和多样化,更易导致微生物出现高度多重耐药性。有人从肾病患者尿管上的混合微生物生物被膜中分离出高度耐受万古霉素的金黄色葡萄球菌,该菌同时耐受耐氨基糖苷类、喹诺酮类、大环内酯类、青霉素、四环素等多种抗菌药物,PCR分析该菌的耐药基因,发现该菌携带有由多种耐药基因组合而成的多重耐药基因簇,包括四环素耐药基因tet基因,er mB-aadE-sat4-aphA-3,大环内酯类外排泵基因m srA基因,以及氨基糖苷类耐药基因aac(6′)-aph(2′′)-Ia等,该研究认为混合微生物生物被膜中细菌之间的密切接触为外源耐药基因的水平转移提供了便利,同时生物被膜微环境增强了这些耐药基因的作用[19]。

1.5 QS系统对外排泵的影响

QS系统(quorum-sensing,群体感应系统)是一种微生物间信息传递机制,微生物通过互相传递一种胞外自诱导分子(autoinducer,A I)的浓度来控制整个微生物群体的行为。当A I的浓度随着微生物群体的密度不断升高并达到一定阈值时,就会渗透到细胞内和转录调节蛋白结合,形成转录调节蛋白-信号分子聚合物,此聚合物能够结合到特定的DNA序列上,启动靶基因表达。QS系统能够使原本互相独立的单个游离的微生物统一步伐,群集性地对外界刺激做出反应,显示出单个微生物所不具有的生理功能和生态特征,能够有力的增强微生物群体的生存能力[1]。QS系统参与微生物很多生物学功能的调控如:细菌聚集性、游动性、生物被膜形成,微生物抗生素合成,毒性因子表达,表面活性物质产生,胞外酶产生,质粒的结合转移等[20]。同时,QS系统还参与影响耐药基因表达和微生物的耐药性,如脆弱类拟杆菌的LuxR I系统可以调节bmeB外排泵的表达[21],表皮葡萄球菌QS系统中的agrD和RNAⅢ参与介导细菌对红霉素的耐药性增加[22]。

2 药物外排泵对生物被膜的影响

2.1 外排泵参与生物被膜及QS系统的形成

微生物形成生物被膜是一个动态的过程,包括微生物的初始黏附,微生物的表面锚定,微生物繁殖、聚集成微小菌落,形成复杂的蘑菇状成熟生物被膜,生物被膜内微生物的分离[23]。最近发现外排泵可以辅助细胞间的信号分子传导,协助生物被膜形成QS系统:类鼻疽假单胞菌的BpeABOpr B外排泵是一个诱导外排系统,bpeR是类鼻疽假单胞菌生物被膜产生的A I中的一种,研究发现BpeAB-Opr B外排泵是合成bpeR所必需的,其功能影响了自诱导分子合酶BpsI的表达[24]。需要注意的是,外排泵的存在并不总是有利于微生物生物被膜,有研究发现SmeDEF外排泵过表达造成微生物营养的损耗,由此抑制了微生物生长和毒力[3]。

2.2 药物外排泵和生物被膜外基质对抗菌药物的抵御作用

生物被膜外的基质成分可以减慢或阻止抗生素渗透到生物被膜中,例如氟喹诺酮类抗菌药物可以缓慢渗透入生物被膜的胞外基质,且因其在基质中浓度过低不能有效发挥作用,还易诱发β-内酰胺酶的表达而被水解[1],这类机制可能取决于基质中多糖物质的黏附、正负电荷的吸附、抗菌素灭活酶的钝化作用[25]以及迂曲的渗透途径[26]。但有些药物虽能通过外基质但仍无疗效,例如氟化喹啉可以轻易穿透大部分微生物生物被膜,氨苄青霉素也可以穿透缺乏β-内酰胺酶的肺炎杆菌生物被膜,但生物被膜深层的微生物并不能被清除,这可能得益于药物外排泵的表达上调,协助微生物将渗透入生物被膜的抗菌药物排出细胞外,铜绿假单胞菌的MexAB-Op rM和MexCDOprJ外排泵已被证明是介导生物被膜耐药特别是对大环内酯类阿奇霉耐药的具体机制[27]。

2.3 抵抗免疫清除

在宿主体内,生物被膜中大量的黏性基质包裹着微生物,形成了一个物理屏障,可以将微生物和机体免疫系统隔开,使机体的吞噬细胞和杀伤细胞及其所分泌的酶不能对微生物产生有效的攻击;生物被膜还可以调节宿主体内细胞因子的产生、抵御免疫细胞的吞噬调理作用,如铜绿假单胞细菌生物被膜可增加γ干扰素分泌从而抑制白细胞吞噬作用[28]。研究发现药物外排泵也可参与微生物对宿主免疫系统的作用,如在杆状细菌李斯特菌中,MdrL、Md rM、MdrT外排泵转运蛋白可影响宿主的免疫应答,调节细胞因子如Ⅰ型干扰素的合成,这种作用可能是由于外排泵释放了与宿主细胞因子相似或接近的物质分子干扰所致[29]。

3 对药物外排泵和微生物生物被膜同时有调控作用的物质

现已发现某些物质可对微生物生物被膜和药物外排泵同时具有调节作用:四环素可同时促进白色念珠菌生物被膜形成和外排泵表达,在培养生物被膜同时加入一定浓度的四环素,可通过增加菌丝出芽对白色念珠菌生物被膜的形成有轻度促进作用,同时上调了CDR1外排泵的表达[30];脆弱类拟杆菌如暴露于0.15%胆汁盐或非结合型胆汁盐中,可增加RND型外排泵编码基因和主要外膜蛋白OmpA的表达,并表现出微生物聚集性、对肠上皮细胞的黏附力和生物被膜形成均显著增加[31]。有研究发现添加外排泵抑制剂如甲硫达嗪、β-盐酸苯甲酰精氨酰萘胺(PAβN)或1-(1-萘甲基)哌嗪,可以减弱相对应的外排泵的功能,抑制大肠埃希菌的生物被膜形成,并增强抗菌药物的杀菌作用[32];而外排泵抑制剂PAβN和铁螯合剂(如2,2′-联吡啶,乙酰氧肟酸,乙二胺四乙酸即EDTA等)联合作用,可以抑制铜绿假单胞菌细菌生长和生物膜的形成[33]。

4 展 望

综上所述,药物外排泵和微生物生物被膜在微生物耐药机制中扮演着密切相关的重要角色:微生物生物被膜形成后常导致微生物耐药性增强、多重耐药性,并常增强微生物对环境的抵抗力,使之难以清除而导致临床相关感染的难治性,而药物外排泵的存在又对生物被膜的生长、耐药性等具有促进增强作用,二者共存使常规抗菌药物的疗效面临着严峻考验。目前,迫切需要合适的药物对微生物生物膜这一特点进行有效治疗。像外排泵抑制剂这样能同时抑制药物外排泵活性和生物被膜生长的药物或化学成分,能够更有力地清除微生物生物被膜,削弱药物外排泵的作用,降低微生物抗药性,对生物膜感染所致的临床疾病具有更大的治疗潜力。

[1] HøibyN,Bjarnsholt T,GivskovM,et al.Antibiotic resistance of bacterial biofilms[J].Int J Antimicrob Agents,2010,35(4):322-332.

[2] Mäkinen KK,Isotupa KP,Kivilompolo T,et al.Comparison of erythritol and xylitol saliva stimulants in the control of dental plaque and mutans streptococci[J].Caries Res,2001,35(2):129-135.

[3] Li XZ,Nikaido H.Efflux-mediated drug resistance in bacteria:an update[J].Drugs,2009,69(12):1555-1623.

[4] Perumal P,Mekala S,ChaffinWL.Role for cell density in antifungal drug resistance in Candida albicans biofilms[J].Antimicrob Agents Chemother,2007,51(7):2454-2463.

[5] S.Islam,H.Oh,S.Jalal,et al.Chromosomalmechanismsof aminoglycoside resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from cystic fibrosis patients[J].ClinMicrobiol Infect,2009,15(1):60-66.

[6] Gillis RJ,White KG,Choi KH,et al.Molecular basis of azithromycin-resistant Pseudomonas aeruginosa biofilms[J].Antimicrob Agents Chemother,2005,49(9):3858-3867.

[7] ZhangL,Mah TF.Involvement of a novel efflux system in biofilm-specific resistance to antibiotics[J].J Bacteriol,2008,190(13):4447-4452.

[8] HocquetD,Berthelot P,Roussel-DelvallezM,et al.Pseudomonas aeruginosa may accumulate drug resistance mechanis ms without losing its ability to cause bloodstream infections[J].Antimicrob Agents Chemother,2007,51(10):3531-3536.

[9] Brooun A,Liu S,Lewis K.A dose-response studyof antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms[J].Antimicrob Agents Chemother,2000,44(3):640-646.

[10] Mukherjee PK,Chandra J,KuhnDM,et al.Mechanism of fluconazole resistance in Candida albicans biofilms:phase-specific role of efflux pumps and membrane sterols[J].Infect Immun,2003,71(8):4333-4340.

[11] 亓庆国,周学东,杨德琴,等.白假丝酵母菌药物流出泵基因在生物膜中表达的动态研究[J].华西口腔医学杂志,2007,25(4):327-330.

[12] Lynch SV,Dixon L,BenoitMR,et al.Role of the rapA gene in controlling antibiotic resistance of Escherichia coli biofilms[J].Antimicrob Agents Chemother,2007,51(10):3650-3658.

[13] K.Driffield,K.Miller,M.Bostock,et al.Increasedmutability of Pseudomonas aeruginosa in biofilms[J].J Antimicrob Chemother,2008,61(5):1053-1056.

[14] Lister PD,Wolter DJ,Hanson ND.Antibacterial-resistant Pseudomonas aeruginosa:clinical impact and complex regulation of chromosomally encoded resistance mechanis ms[J].Clin Microbiol Rev,2009,22(4):582-610.

[15] Xu L,Li H,Vuong C,et al.Role of the luxS quorum-sensing system in biofilm formation and virulence of Staphylococcus epider midis[J].Infect Immun,2006,74(1):488-496.

[16] T.C.Conibear,S.L.Collins and J.S.Webb.Role of mutation in Pseudomonas aeruginosa biofilm development[J].PLoS One,2009,16,4(7):e6289.

[17] Beloin C,Valle J,Latour-Lambert P,et al.Global impact of mature biofilm lifestyle on Escherichia coli K-12 gene expression[J].MolMicrobiol,2004,51(3):659-674.

[18] 李乐,夏忠弟,胡朝晖,等.鲍曼不动杆菌Ⅰ类整合酶基因在生物被膜内的表达及耐药分析[J].中南大学学报学版,2008,33(10):952-957.

[19] WeigelLM,Donlan RM,Shin DH,et al.High-level vancomycin-resistant Staphylococcus aureus isolates associated with a polymicrobial biofilm[J].Antimicrob Agents Chemother,2007,51(1):231-238.

[20] LazarV.Quorum sensing in biofilms-How to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power?[J].Anaerobe,2011,8[Epub ahead of print].

[21] Pumbwe L,Skilbeck CA,Wexler HM.Presence of quorumsensing systems associated withmultidrug resistance and biofilm formation in Bacteroides fragilis[J].Microb Ecol,2008,56(3):412-419.

[22] 贾宁,徐志凯,袁云娥,等.表皮葡萄球菌全面调节子的表达在生物被膜耐药性中的作用[J].第四军医大学学报,2007,28(7):600-602.

[23] Van Houdt R and Michiels CW.Role of bacterial cell surface structures in Escherichia coli bio film formation[J].ResMicrobiol,2005,156(5-6):626-633.

[24] Chan YY,Chua KL.The Burkholderia pseudomallei BpeABOprB efflux pump:expression and impact on quorum sensing and virulence[J].J Bacteriol,2005,187(14):4707-4719.

[25] StrathmannM,W ingenderJ,FlemmingHC.Application of fluorescently labelled lectins for the visualization and biochemical characterization of polysaccharides in biofilms of Pseudomonas aeruginosa[J].J MicrobiolMethods,2002,50(3):237-248.

[26] Thurnheer T,GmürR,Shapiro S,et al.Mass transport of macromolecules within an in vitro model of supragingival plaque[J].Appl Environ Microbiol,2003,69(3):1702-1709.

[27] KvistM,HancockV,Klemm P.Inactivation of effluxpumps abolishes bacterial biofilm for mation[J].Appl Environ Microbiol,2008,74(23):7376-7382.

[28] Leid JG,Willson CJ,ShirtliffME,et al.The exopolysaccharide alginate protects Pseudomonas aeruginosa biofilm bacteria from IFN-gamma-mediated macrophage killing[J].J Immunol,2005,175(11):7512-7518.

[29] Crimmins GT,HerskovitsAA,Rehder K,et al.Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters activate a cytosolic surveillance pathway of innate immunity[J].Proc Natl Acad SciUSA,2008,105(29):10191-10196.

[30] McCoolL,Mai H,Ess mann M,et al.Tetracycline effects on Candida albicans virulence factors[J].Infect DisObstet Gynecol,2008:493508.

[31] Pumbwe L,Skilbeck CA,Nakano V,et al.Bile salts enhance bacterial co-aggregation,bacterial-intestinal epithelial cell adhesion,biofilm formation and antimicrobial resistance of Bacteroides fragilis[J].Microb Pathog,2007,43(2-3):78-87.

[32] Kvist M,Hancock V,Klemm P.Inactivation of effluxpumps abolishes bacterial biofilm formation[J].Appl Environ Microbiol,2008,74(23):7376-7382.

[33] Liu Y,Yang L,Molin S.Synergistic activities of an efflux pump inhibitor and iron chelators against Pseudomonas aeruginosa growth and biofilm formation[J].Antimicrob Agents Chemother,2010,54(9):3960-3963.