三萜化合物及其 N MR研究进展

2011-03-19任雪琴任晓慧张长春

武汉轻工大学学报 2011年1期

任雪琴,任晓慧,吴兵,张长春,陈新

(武汉工业学院生物与制药工程学院,湖北武汉 430023)

三萜化合物是以六分子异戊二烯为单位的聚合体。由于三萜化合物生物活性的多样性及重要性,近年来成为中药化学研究的一个热点领域,而加之现代分离鉴定手段先进,NMR技术的应用,大大加快了三萜化合物的研究进展。

据三萜化合物在生物体内的存在形式、结构和性质,可分为两大类：三萜皂苷及其苷元、其他三萜类 (包括树脂、苦味素、三萜生物碱及三萜醇等)。但一般则根据三萜类化合物碳环的有无和多少进行分类。目前已发现的三萜类化合物,多数为四环三萜和五环三萜,少数为链状、单环、双环和三环三萜。近几十年来还发现了许多由于氧化、环裂解、甲基转位、重排及降解等而产生的结构复杂的高度氧化的新骨架类型的三萜类化合物。

1 三萜化合物的生理活性

三萜化合物的生理活性：三萜类化合物具有广泛的生理活性。通过对三萜类化合物的生物活性及毒性研究结果显示,其具有溶血、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降低胆固醇、杀软体动物、抗生育等活性。如乌苏酸是夏枯草的抗癌活性成分,雪胆甲素是山苦瓜的抗癌活性成分。

1.1 抗肿瘤活性

三萜化合物具有广泛抗肿瘤生物活性,在自然界中的分布广泛。其中具有显著抗肿瘤活性的主要包括四环三萜和五环三萜。其作用机制主要通过诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤新生血管生成和在线粒体以及基因水平发挥抗肿瘤活性。同时,该类化合物具有明显的抗癌药物协同作用[1]。

三萜类化合物对多种癌细胞株有抗癌活性,抗癌活性较强的有达玛烷型四环三萜人参皂苷 Rg3、Rh2和原人参二醇,羽扇豆烷型五环三萜白桦脂酸,木栓烷型五环三萜南蛇藤素和扁蒴藤素[1]。人参皂苷 Rg3、Rh2与环磷酰胺联合用药能增强环磷酰胺的抗肿瘤活性,同时降低其毒副反应。人参皂苷Rg3与环磷酰胺联合用药具有抗血管生成协同作用,抑制肿瘤生长效果显著,此外还能降低机体耐药系统的敏感性。Rg3与三氧化二砷联合用药对抑制移植瘤肝癌细胞增殖有协同作用,因为 Rg3抑制肿瘤生长主要是通过抑制肿瘤血管生成,而三氧化二砷对肿瘤生长的抑制作用是通过抑制 PCNA蛋白的表达实现的。Rg3联合 5-FU诱导肝癌细胞凋亡作用比单用 Rg3或 5-FU明显。葫芦素 B与多西他奇联合用药对诱导 Hep-2细胞凋亡没有协同作用。总之,三萜类化合物在肿瘤的治疗与预防领域具有较好的开发和应用前景。

1.2 抗 HIV活性

白桦脂酸 (betulinic acid,BA)最早分离自生长于非洲东部的鼠李科常绿植物 Ziziphusm auritiana Lam.的树皮[2],属于五环三萜类化合物。1994年T.Fujioka等首次发现了 BA的抗 HIV活性[3]。随后,有关 BA及其衍生物的抗 HIV活性引起人们极大关注。

大量研究表明,BA类化合物抗 HIV作用是通过阻止 HIV进入宿主细胞和阻止 HIV在宿主细胞中的成熟两个途径实现,完全不同于目前临床抗HIV药物通过作用于病毒的逆转录酶 (RT)和蛋白酶(PR)这两个靶点的作用机理,对解决目前临床抗HIV药物引发的耐药性和副作用这一关键问题提供思路,并为新型抗 HIV药物开发带来了新的希望[4]。

皂角刺中含有丰富的白桦脂酸型三萜,其中有些显示出强烈的抗 HIV活性,这对抗 HIV新药开发和皂角刺新的药用功效开发有重要实用价值。通过化合物化学结构与药理活性之间的关系考察发现,白桦脂酸型三萜类化合物分子中 C3位-OH上苯丙稀酸类基团取代会导致其抗 HIV活性大幅度下降,这对该类化合物的作用机理研究及分子修饰和结构改造有重要的参考意义[5]。

1.3 抗抑郁活性

积雪草的有效成分积雪草三萜皂苷具有明显的抗抑郁作用。秦路平、陈瑶、郑汉臣[6]等人通过强迫游泳试验和未预知的长期温和应激刺激试验对积雪草三萜总苷的抗抑郁作用进行了研究,发现积雪草三萜总苷能明显地缩短强迫游泳不动时间、改变大鼠的抑郁行为、防止抑郁大鼠大脑皮层和海马神经元结构和形态的变化以及神经内分泌的紊乱,显示出较好的抗郁作用。

1.4 抗衰老活性

大豆皂苷是一类由齐墩果烷型三萜苷元与低聚糖链接而成的三萜皂苷,具有多种药理活性,其中大豆皂苷抗衰老作用尤为明显。大豆皂苷在一定程度上促进细胞超氧化岐化酶 (SOD)的合成,从而使细胞增加抗自由基能力,延缓衰老过程。高学敏[7]等人从人胚肺二倍体成纤维细胞培养研究中发现,大豆皂苷由于能调整细胞内环腺苷酸含量,从而提高DNA修复功能,增加细胞抵抗不良环境的能力。

1.5 其他生物活性

三萜化合物除了以上主要的几种生物活性外,还具有其它生物活性。枇杷三萜酸主要含熊果酸和齐墩果酸,三萜酸具有减肥、降血糖、抗肝损伤、抗菌消炎和抗病毒等多种生物学活性[8]。罗艳等人[9]研究发现吉林地榆中的三萜皂苷类成分具有良好的抗炎活性。姜北等人[10]筛选研究发现,腺花香茶菜中的三萜化合物对肿瘤细胞具有一定的细胞毒活性。

2 几种天然三萜化合物的 NMR研究进展

2.1 NMR原理及解谱方法

核磁共振波谱是以兆周 (10-1-102MHz)数量级的电磁波作用于原子核,原子核产生自旋跃进所得的吸收谱。核磁共振现象来源于原子核的自旋角动量在外加磁场作用下的进动。一般根据化学位移鉴定基团;由耦合分裂峰数、偶合常数确定基团联结关系;根据各 H峰积分面积定出各基团质子比。核磁共振谱可用于化学动力学方面的研究,如分子内旋转,化学交换等,因为它们都影响核外化学环境的状况,从而谱图上都应有所反映。核磁共振还用于研究聚合反应机理和高聚物序列结构。

H谱、C谱是应用量广泛的一维核磁共振谱,较常用的还有 F、P、N等核磁共振谱。核磁共振适合于液体、固体。如今的高分辨技术,还将核磁用于了半固体及微量样品的研究。核磁谱图已经从过去的一维谱图 (1D)发展到如今的二维 (2D)、三维 (3D)甚至四维 (4D)谱图,陈旧的实验方法被放弃,新的实验方法迅速发展,它们将分子结构和分子间的关系表现得更加清晰。

所以在这些理论基础上新的化合物不断地被发现,人们在三萜化合物的研究上也在不断的努力。

2.2 新型灵芝三萜类化合物13 CNMR的谱学特征

13CNMR中最易分辨的信号是烯碳原子,当双键位于不同类型母核或同一母核的不同位置时,其碳原子化学位移有明显差别。13CNMR除用于确定骨架外,对于解决某些立体化学问题也很有帮助。

灵芝三萜类化合物属于高度氧化的羊毛甾烷或降羊毛甾烷类衍生物,按所含碳原子数目可分为C30、C27和 C24主要三大类型;在近 l0余年发现的灵芝三萜化合物中,有不少具有变型的化学结构,A环开环的就是比较典型的例子。

灵芝三萜类化合物母核上 C3、C7、C12、C15的取代基不同时,对其相邻碳的化学位移有较大影响。C3连有羰基时 ,Cl、C2、C4的化学位移分别为 δC35～37(t),δC34～35(t),δC46～47(s);C3连有羟基时 ,此 3个碳的化学位移均向高场位移,其化学位移分别为δC33～34(t),δC26～27(t),δC37～38(s)。C7连有羰基时 ,C6δC33～37(t);C3连有羟基时 ,C6δC26～28(t)。C15连有羰基时 ,C14δC57～59(s);C15连有羟基时 ,C14δC52～53(t)[11]。

确定相对构型时,可根据1H NMR的化学位移变化来确定。当 C3、C7、C12、C15连有羟基时 ,随着羟基构型的不同,该羟基偕氢的化学位移和偶合常数也会有相应的改变。

灵芝三萜化合物中,出现的双键较多,各种位置都会出现烯键,A环、B环上的双键多出现在 C7-C8,C8-C9,C9-C11和侧链上双键出现在 C24-C25,C20-C22的较多。在烯键处于 C7-C8和 C9-C11这类化合物中,C7一般出现在δC120—121(d),C8一般出现在δC140—142(s),C9一般出现在 δC141—145(s),C11一般出现在δC115—117(d)。从烯键的13CNMR化学位移,推测灵芝三萜中的双键位置,变得十分简单。侧链上的双键位置有 C20-C22和 C24-C25两类,在 C20-C22这类化台物中,C20一般位于δC154—157(s),而C22基本上出现在 δC124.3—124.7(d),后者 C24则出现在δC139—145(d),C25出现在δC126—129(s),侧链上双键位置的13CNMR数据十分特征,很容易判断烯键所在的位置。

2.3 夏枯草属植物三萜类化合物13 CNMR的谱学特征

查阅国内外研究文献,对夏枯草属植物中三萜类成分进行总结,并对其13CNMR波谱特征进行归纳、分析。夏枯草属植物中含有多种三萜化合物,主要为齐墩果烷型、乌苏烷型和羽扇豆烷型三萜。迄今分离得到几十个三萜化合物,皂苷的糖链多数连接在 28位,较少连接在 3位或者其它位,而 28位糖链也只是由 1个或 2个单糖所组成[12]环三萜化合物类型较多,核磁共振波谱较为复杂,这里仅就常见的齐墩果烷型和乌苏烷型五环三萜的部分13CNMR波谱特征加以总结。

2.3.1 齐墩果-12-烯和乌苏-12-烯的骨架特征

这两类不同骨架化合物最明显的特征表现为C12,C13的化学位移不同。在齐墩果-12-烯结构中,C12,C13分别为 δC125,δC145,而乌苏 -12-烯中 ,C-12,13分别为δC125,δC139,略有差异。当结构中 27位上有-COOH或-CH2OH时,C12δC向低场移动约 1—8,同时 C13δC向高场移动约 5—7,当齐墩果 -12-烯有19-OH取代也产生相似效应。两类结构的另一个特征是乌苏-12—烯有比齐墩果-12-烯比化学位移大50的 C信号 ,即其 C19位有 CH3取代基 ,乌苏-12-烯的 C18信号比齐墩果-12-烯 (无 19位-OH取代)向低场位移约 10以上。另外,18α-H也影响了 C12,C13的化学位移值。

2.3.2 羟基取代效应对三萜化合物的13CNMR的影响

对各种类型单羟基或多羟基取代三萜的13CNMR数据进行研究发现,羟基取代可引起α-C,β-C分别向低场移动 34～50,2～10,而γ-C则向高场移动 0～9。

2.3.3 羟基位置和构型对三萜化合物的13CNMR的影响

在齐墩果-12-烯结构中,与 C29,C30位羧基或甲基取代时,C19,C21化学位移值向高场移动 4—6;C20向低场移动,若被羧基取代,移动约为 13,若被羟甲基取代则移动约为 5,此时 C20连接的甲基碳的化学位移值向高场位移约 4—5。

C23有-CH2OH(e键)化学位移值约为 68,比 24-CH2OH(约为 64)总处于低场;和 23,24-CH3比较,当有 23-CH2OH取代时,使 C-4向低场位移约 4,C-3,C-5和 C-24(CH3)向高场位移约 4和 2.4。当有24-CH2OH取代时,也使 C-4的化学位移值向低场位移约 4,C-23(CH3)向高场位移约 4.5,但对 C-3和 C-5影响较小。

3β-OH取代与相应的 3α-OH取代的化合物比较,C-5的化学位移向高场位移 4.2～7.2,C-24向低场位移 1.2～6.6。当 2位有羟基取代时,C-2的化学位移值总是比 C-3(78.2～83.8)处于高场,从而使 C-1的化学位移向低场位移约 5～10。

三萜化合物 C-16,C-19和 C-15,C-18分别具有16α-OH和 16β-OH构型,两者的不同很容易从 C-16的化学位移上看出来。具有 16α-OH的 C-16化学位移 (74.0)比其具有 16β-OH构型的异构体的 C-16化学位移 (67.5)向低场移动约 5.5。

2.4 其它天然三萜化合物的NMR研究进展

王英等人[13]从亮叶杨桐中分离得到 6个三萜皂苷化合物,通过波谱和化学方法鉴定了它们的结构,其中 1个为新化合物,另外 5个为首次从亮叶杨桐中分离得到。亮叶杨桐叶在广西民间被作为代茶饮料已有悠久历史了,其叶有较明显的消炎、解毒、止血和降压功效[14]。民间还常用以治疗腮腺炎、痢疾和高血压等[15]。

张翠仙等人[16]从岭南地区的毛冬青根中分离得到 2个三萜类化合物,经理化及波谱方法鉴定了其结构,并且首次利用 2D NMR技术对此 2个化合物的1H NMR和13CNMR数据进行了全归属。前期药理学活性表明毛冬青总三萜皂苷具有明显降低血浆粘度的作用。

刘玥辉等人[17]应用 2D NMR技术,首次对蒙古黄芪中环阿屯烷型四环三萜代表性化合物黄芪甲苷的1H NMR和13CNMR信号进行了准确归属,对其他 6个环阿屯烷型皂苷的13CNMR信号进行准确归属,结果确定了其相对构型。

欧阳明安[18]从满树星中分离出一种 18,19-裂乌索酸型三萜皂苷-满树星苷 Ⅰ,经1H NMR,13CNMR,DEPT,1H-1H COSY,HMBC,HMQC和NOESY谱鉴定,确定了该化合物的碳骨架结构,并且对该化合物的NMR信号进行了全归属。

张慧等人[19]从中药乌骨藤中分离得到 4种五环三萜单体化合物,分别为β-香树脂醇、白桦酯醇、白桦酯酸和羽扇豆醇,并且利用核磁共振谱、质谱、红外光谱等分析手段鉴定这 4个化合物,其中后 3个化合物具有抗肿瘤活性[20]。

同样,杨光忠等人[21]从雷公藤根心部分分离得到一个纯的三萜化合物,经过光谱分析 (HPE IMS,1H NMR,13CNMR,HMBC,HMQC,NOESY)鉴定其结构为 3β,22β-dihydroxy-29-nor-D：A-friedoolean-21-one-2β,24-lactone,经过比对此化合物为一个新的三萜化合物。

3 结束语

三萜化合物具有多种生物活性,其结构也比较复杂,给鉴定工作带来了一定难度。至今,仍然有很多新型三萜化合物被不断发现,利用 NMR化学位移数据分析,确定有活性的三萜化合物的结构是很有意义的。但是,仅仅利用 NMR技术是很难确定三萜化合物结构的,然而,联合化学方法、质谱和NMR技术会使三萜化合物的结构明晰化,将经典方法与现代仪器分析手段结合使用,综合互补,才能更清晰地解析三萜皂苷化合物的正确结构。

[1] 刘金平,李亚平.三萜类化合物抗癌活性研究进展[J].特产研究,2010,1(1)：65-69.

[2] Plsha E,Chal H,Lee L S,et al.Discovery of betulinic acid as as elective inhibitor of human melanoma that functions by induction of apoptosis[J].Nat Med,1995,17(1)：1046-1051.

[3] Fujiolka T,Kashiwada Y,Kilkuskie R E,et a1.Anti-A IDS agents,11 betulinic acid and platonic acid as anti-HIV principles from Syzihium claviflorum,and the anti-HIV activity of structurally related triterpenoids[J].Nat Prod,1994,57(2)：243-247.

[4] Aiken C,Chen C H.Betulinic acid derivatives as HIV-1 antivirals[J]. Trends in Molecular Medicine,2005,11(1)：31-36.

[5] 李万华,李琴,王晓刚,等.皂角刺中 5个白桦脂酸型三萜抗 HIV活性研究[J].西北大学学报 (自然科学版),2007,37(3)：401-403.

[6] 秦路平,陈瑶,郑汉臣.积雪草的品质评价和抗抑郁作用研究.2004,全国第六届天然药物资源学术研讨会.

[7] 高学敏等.大豆总皂苷抗衰老作用的研究(I)[J].食品工业科技,1999,(增刊).

[8] 杨庆新,黄建安,刘仲华,等.枇杷叶中三萜酸的研究进展 [J].食品工业科技,2008,29(3)：282-284.

[9] 罗艳,王寒,原忠.地榆中三萜皂苷类成分及其抗炎活性研究 [J].中国药物化学杂志,2008,18(2)：138-140.

[10] 姜北,韩全斌,项伟,等.腺花香茶菜中的三萜化合物[J].云南植物研究,2002,24(5)：663-666.

[11] 乔英,杨叶昆,董学畅,等.13CNMR在新型灵芝三萜类化合物的应用 [J].波谱学杂志,2005,22(4)：437-455.

[12] 王祝举,赵玉英,陈雅妍,等.夏枯草属植物三萜类化学成分及13CNMR波谱特征[J].中国中药杂志,2000,25(10)：583-587.

[13] 文才,殷志琦,等.亮叶杨桐的三萜皂苷类成分 [J].药学学报,2008,43(5)：504-508.

[14] Chen M Z,Yu J,She G Z,et al.Analysis of nutritional components and medicinal components in wild Shi Ya Cha[J].Nat Prod Res Deve,1996,8：85-86.

[15] Yuan P,Wang GL,Qian S H,et al.Analysis of active compenents in Shi Ya Cha[J].Food Sci,1998,8：75.