戴诗皎,李 睿

(武汉工业学院生物与制药工程学院,湖北武汉 430023)

金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus,以下简称金葡菌)是一种人畜共患病的重要致病菌,是国内外最常见的细菌性食物中毒病原之一。据美国疾病预防控制中心报告,由金葡菌引起的食物中毒仅次于大肠埃希氏菌,居第二位,占细菌性食物中毒的33%[1]。在我国,由金葡菌引起的食物中毒约占细菌性食物中毒事件的 25%,而在美国、加拿大等发达国家,更是高达 50%[2-3]。

金葡菌对外界的抵抗力在非芽胞菌中为最强,干燥情况下能存活数月。该菌引起中毒的主要原因是产生耐热肠毒素。肠毒素是一种耐热性很强的毒素,煮沸 1.5—2 h仍能保留毒性[3]。因此普通的烹饪方法不易将其破坏。一旦食物被金葡菌污染则极易引起食源性疾病的暴发。

1 金葡菌的流行概况

世界上许多国家都曾相继报道金葡菌的暴发流行。该菌引起的食物中毒临床表现主要以恶心、呕吐和腹痛为主,少数病人有腹泻、头痛、头晕、发热、脱水等症状。发病较多的国家主要有美国、加拿大和日本。根据日本卫生部公布的数字,日本 1980-1999年由金葡菌引起的食物中毒共有 2525次,59964人感染,3人死亡[4]。而在 2000年发生的“雪印奶粉”事件中,日本最大的牛奶企业雪印乳制品生产公司因奶制品被金葡菌污染,造成 13420人食物中毒,直接经济损失为 139亿日元,企业形象被破坏造成的间接经济损失约为 200-700亿日元[4]。

我国每年发生的金葡菌食物中毒事件也非常多,全国各地均有报道。2003年 9月,三明市某中学西藏部食堂发生一起食用被金葡菌污染的熏鸭翅引起的 35名学生食物中毒事件[5]。同年 9月,某校幼儿园班的 26名学生因食用某一蛋糕店送来的蛋糕后,先后有 11名学生出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻等症状,后证实为金葡菌污染蛋糕所致[6]。2006年 6月 23日,新疆特克斯县城镇阿克塔斯牧业村一户牧民举办祭悼仪式聚餐,引发了一起急性食物中毒。就餐者 120人,发病 88人,催患率为 73.33%。事后根据流行病学调查、患者临床症状及实验室检验分析,证实为由金葡菌污染食品引起[7]。2008年8月 24日四川泸市江阳区某酒店发生一起食物中毒,经流行病学调查、临床表现及实验室检查,确认为一起金黄色葡萄所致的食物中毒,进餐的 350人中有 82人出现不同程度的恶心、呕吐、腹痛、腹泻等症状[8]。类似的金葡菌食物中毒事件在我国时有发生。

2 传染源及传播途径

金葡菌感染是一种食源性疾病。牛肉、牛奶、乳制品、豆制品、卤味、熟食、剩饭、剩菜等均可成为传染源。金葡菌在自然界广泛存在于空气、水、尘埃及人和动物的排泄物中,所以食品受其污染的机会较多。被金葡菌感染的人 (包括食品加工人员、炊事员或销售人员带菌)加工食品时均可造成食品污染;生、熟食交叉,熟食制品包装不严,冷藏不足也可引起污染;食品运输过程受到污染;奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时,对肉体其他部位及牛奶也可造成污染;热处理不足、加工后食物在室温存放时间过久等,都可能造成金葡菌的污染。在大规模食品加工过程中如不注意卫生生产,将容易导致金葡菌的污染,从而导致食物中毒的集体式和家庭式暴发。

金葡菌感染具世界流行性、高发病率和集体式暴发等特点,严重危害人类安全和健康,已成为一个全球性的公共卫生问题,受到世界各国广泛关注。

3 肠毒素 (Staphylococcal enterotoxins,SE)

金葡菌引起疾病的原因主要是产生毒素、酶类等致病性物质。该菌产生的主要酶类有：凝固酶、耐热核酸酶、葡激酶等;产生的主要毒素有：肠毒素、葡萄球菌溶素、表皮剥脱毒素、杀白细胞素、毒性休克综合征毒素-1等,其中肠毒素 (SE)在该菌的致病性中起着重要的作用[9]。据报道,每 100 g食物中含18μg SE时即能引起金葡菌食物中毒[10]。金葡菌中毒的实质是耐热肠毒素中毒,只有检测出肠毒素,才能为金葡菌中毒下最后的结论。因此,研究 SE尤其是 SE的检测和分型工作,对由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒临床诊断和预防该菌引起的食物中毒均有重要的意义。

SE是金葡菌分泌的一组具有超抗原活性的细菌毒素,易溶于水和盐溶液,对热很稳定,可耐受100℃煮沸 30min仍有致病性,能抵抗胃肠液中蛋白酶的水解作用[11]。依据 SE抗原性和等电点的不同 ,至今为止发现 SE有 A、B、C(C1、C2、C3)、D、E、F、G、H、I和 J等 10个毒素血清型,A和 D型最为常见,其中以 A型的毒力最强,摄入 1μg即能引起中毒。

4 肠毒素的检测方法

金葡菌食物中毒是因进食含有肠毒素的食物,并非活菌所引起,所以研究出快速、灵敏的检测肠毒素的方法是有效控制食物中毒的重要手段。

检测肠毒素的传统方法需要经过增菌、分离培养、生化鉴定等一系列繁琐步骤来完成,费时费力。目前食品卫生的快速检验中主要采用血清学反应检验金黄色葡萄球菌肠毒素,通常采用的方法有免疫荧光法和酶联免疫吸咐法。随着研究的深入,一些快速的采用现代技术的检测方法不断出现,这些新的检测方法,一般都缩短了传统检测方法的时间,能够快速地得到检测结果,并且操作相对简单。本文介绍几种快速检测 SE的方法。

4.1 动物学试验

一般是对幼猫或猴腹腔注射或喂食肉汤培养物或呕吐物,然后观察其可能出现的各种异常生理和形态变化,一般 4h内受试动物发生呕吐、腹泻和体温升高或死亡等现象的,提示 SE存在。此法是测定食物中肠毒素较早采用的一种方法。但由于猴的来源困难,成本较高,而用幼猫做为研究对象时,葡萄球菌产生的其他非肠毒素类产物也可致幼猫呕吐,容易出现假阳性,故此类方法受到了极大的限制。

4.2 血清学实验

血清学试验是通过将肠毒素作为抗原和特异性抗体发生结合性反应,来检验食品中金葡菌肠毒素。主要有免疫双扩法 (DD)、反向间接血凝法(RPHA)、反向乳胶凝集试验 (RPLA)、放射免疫测定法 (R IL)、免疫印迹技术 ( Immunobloting)以及酶联免疫吸附实验(ELISA)等。目前在食品卫生检验中主要采用的方法有两种：放射免疫测定法和酶联免疫吸附法。

4.2.1 放射免疫测定法 (Radioimmunoassay,R IA)

自从 1968年Momrae、Johnson等用 R IA检测 SE获得成功后,很多实验室就利用 R IA检测培养液和食品中提取的肠毒素[9]。放射免疫测定法是建立在标记抗原和非标记抗原对特异性抗体的竞争性抑制反应的基础上,将放射性同位素 I125等标记到特异性抗体上,用于检测未知样品中的 SE;或者将同位素标记到肠毒素抗原上,标记 SE与未标记 SE和特异性抗体发生竞争结合,被检材料中未标记的 SE可抑制标记 SE与相应抗体的结合,抑制程度与标本中肠毒素的浓度成正比。通过测定复合物中标记肠毒素的减少程度,可对检样中同型肠毒素进行定量。R IA法检测肠毒素虽快速但要求较高,工作人员必须进行专门训练,且该法使用了放射性物质,废物处理比较烦琐,因此限制了 R IA法的使用和普及。

4.2.2 酶联免疫吸附试验 (Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)

ELISA是将抗原或抗体先结合到某固相载体的表面,利用酶标记的抗原或抗体与之结合形成复合物,加入底物显色后,根据颜色的深浅确定被检物的含量。该法自 1971年建立后被广泛应用于多种疾病的免疫血清学检测。目前常用双抗体夹心法检测SE[12],其灵敏度为 1ng/mL,检测速度快,4h就可出结果。王小红等[13]建立了快速检测金黄色葡萄球菌B型肠毒素的间接竞争 ELISA方法,最低检测量为 1ng/ml。段鸿斌[14]的实验结果也显示对不同污染程度的牛奶样品,利用间接竞争 ELISA法检测其SEB残留的灵敏度远远高于生化法。使用 ELISA法检测 SE的报道最多,它具有操作简便、灵敏度高、特异性强、重现性好等优点。但 ELISA试剂易受环境、温度、时间、保存方法等因素的影响,使其具有可变性和易变性,且在肠毒素型与型之间有一定程度的交叉反应,易干扰对结果的判定[15]。该法需要制备或购买特异性好、效价高的抗金黄色葡萄球菌的抗体,并且整个过程均为人工操作,可能会由于个人操作不同结果有所差异。

4.3 分子生物学实验

较早采用核酸分子杂交检测法,如：菌落原位杂交法、DNA斑点杂交和印迹杂交技术等检测 SE。随着分子生物学的快速发展,PCR法成为检测金黄色葡萄球菌最常用的方法之一。

聚合酶链反应技术 (Polymerase Chain Reaction,PCR)是一种在体外模拟天然 DNA复制过程,对特定的DNA或DNA片段进行快速扩增的方法。通过设计引物检测产 A—E型葡萄球菌肠毒素的菌株。随着 PCR的发展,多重 PCR和荧光定量 PCR等在SE的检测中得到了广泛的应用。

4.3.1 多重 PCR

由 PCR引申出的多重 PCR法,可用于同时检测肠毒素 A—E(entA、entB、entC、entE)基因 ,表皮剥脱毒素 (eta、etb)基因和中毒性休克综合症毒素(tst)基因等毒力相关因子[16-17]。2000年 Naresh K.Sharma等人用多重 PCR方法检测金葡菌肠毒素A—E,利用了几种毒素基因的通用保守序列及特异序列,即一个相同的上游引物及特异性下游引物,可在 3—4h内检测出毒素基因A～E,且与标准的免疫检测有近 99%的对应性[18]。在此基础上,Mehrotra等人通过两个 PCR反应体系、两对引物同时检测了包括肠毒素 SE、TSST-1、Ets、mecA在内的十种毒素基因,且效果很好[19]。此方法有很好的应用前景。

4.3.2 荧光定量 PCR(Real-time PCR)

常规 PCR是通过检测最终扩增结果而判断是否有足够量靶基因存在,常规 PCR使用的染色剂溴化乙啶有强烈的致癌作用,严重危害操作人员的健康。因此荧光定量 PCR逐步取代常规 PCR成为备受重视的 PCR技术。荧光定量 PCR在 PCR过程中利用荧光染料在光刺激下释放的荧光能量的变化,直接反映出 PCR扩增产物量的变化,荧光信号变量与扩增产物变量成正比,并通过足够灵敏的自动化仪器实现对荧光的采集和分析以达到对原始模板量定量的目的。主要有以下几类：荧光染料直接结合扩增产物,如 SYBB Green I,类似于 EB,能特异性地区分单双链 DNA,只与双链 DNA结合;荧光标记探针,探针可与 DNA模板一对一结合,如 Taqman标记探针、分子信标探针 (Molecular beacon)、Light Cycler T M杂交双探针等。荧光定量 PCR通过标记特异性荧光探针,实行完全闭管式操作,无复杂的产物后处理过程,不仅能大大减少扩增产物的污染机会,提高检测的特异性,且可通过计算机自动分析对扩增产物进行精确定量,完全克服了常规 PCR的缺点。荧光定量 PCR操作简便、快速、灵敏,尤其适用于无活菌或含菌量低的患者标本及已加热杀菌的可疑中毒食品的检测[20-21]。

根据肠毒素的基因设计引物,运用常规 PCR或由常规 PCR引申出的多重 PCR、Real-time PCR、APPCR、Rep-PCR等方法扩增不同血清型的肠毒素,获得不同大小的产物片段可对肠毒素进行分型[22-23]。

PCR方法除了具有核酸分子杂交的优点如特异性强,可从基因水平进行诊断和同时检测大量样品等优点外,比核酸分子杂交更加敏感,更加快速和更加简便,且易自动化操作[24]。但是由于 PCR实验技术要求高,费用高等特点限制了该方法在食品在线检测中的广泛应用。

综上所述,目前检测 SE的方法各有利弊。随着各种技术的不断改进和发展,其检测的灵敏度和特异性均有所提高。但是目前还没有既快速、灵敏又廉价的方法用于食品安全中金葡菌的检测。因此,进一步提高检测手段的灵敏度、特异性及实用性仍是科学工作者研究的重要课题和主要任务。

5 结束语

金葡菌在自然界分布广泛,致病力强,是食物中毒最为常见的病原菌。要防止金葡菌引起的食物中毒的暴发,应严格把好食品安全关,防止食品受到金葡菌的污染;大力加强食品卫生宣传教育、改善环境卫生,加强对个体食品生产经营者的监督管理,防止金葡菌的生长和产毒;做好食品的消毒和杀菌处理工作。

近几年金葡菌耐药菌株和变异菌株不断出现[25-27],给临床治疗和疾病预防控制带来了巨大的挑战,使得基于免疫学和分子生物学基础的检测方法也随着其耐药性的变化而必须作出相应的改进。因此,深入研究金葡菌肠毒素的致病机理,和快速、经济、实用的检测 SE方法仍是现在和今后的研究热点。

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