付 薇,覃芳芸,马 琳,徐贤坤,黄胜斌,易春华,孙翔翔,何奇松,蒋家霞,熊 毅*

(1.广西动物疫病预防控制中心,广西南宁530001;2.广西大学动物科学技术学院,广西南宁530005)

禽流感(Avian influenza,AI)是由正黏病毒科A型流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的一种禽类急性和高度接触性传染病。根据病毒表面糖蛋白凝血素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同,可将A型流感病毒分为16个HA亚型和9个NA亚型[1],其中H9N2亚型属于低致病性禽流感病毒,其流行广泛,感染后家禽以出现呼吸道症状、产蛋率和孵化率下降为主要特征,此外该病毒可以引起免疫抑制而易出现继发感染[2]。该型禽流感病毒自1966年被分离到以来,目前已经普遍存在于各国禽群中;1999年中国香港及广东省发生了H9N2亚型禽流感病毒感染人的病例,先后从禽、猪、人体内均分离到该型病毒[3-4],迫使人类重新认识到禽流感的公共卫生学意义。

AIV基因组由8条不连续的单股负链RNA节段组成,总长度约为13.6 kb,至少编码10种蛋白质[5]。节段1和节段2最长,均为2.3 kb,各有一个开放式阅读框架(ORF),分别编码寡聚酶蛋白PB2(759 aa)和PB1(757 aa)[6]。这两种寡聚酶蛋白均是RNA转录酶的重要成分,具有识别和结合来源于宿主细胞的帽子结构,启动反转录等功能,对病毒进入细胞及病毒的基因表达与复制是必需的[7]。本研究对从广西北海市合浦县分离到的一株鹅源H9N2亚型AIV的PB1和PB2基因病毒进行遗传分析,从分子生物学的角度了解该病毒在不同地区、不同宿主的遗传变异情况,为H9N2亚型禽流感的防控提供一定科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 鹅源H9N2亚型禽流感病毒A/Goose/Guangxi/01/07(简称A/GS/GX/01/07)由广西壮族自治区动物疫病预防控制中心分离保存。1.1.2 主要试剂 T rizol Reagent购自Invitrogen公司,Rnase Inhibitor、M-M LV反转录酶、EX-Taq、Gel Extraction Mini Kit胶回收试剂盒、DNA Marker DL 2 000、pMD18-T载体、限制性内切酶等购自宝生物工程(大连)有限公司,DH5α大肠埃希菌感受态细胞购自北京博迈德科技发展公司。

1.1.3 引物合成 参照国内外已发表的AIV H9N2的PB1、PB2基因序列,应用Oligo6.0设计引物。PB1F:5′-AGCRAAAGCAGGCAAACCATT-3′,PB1R:5′-CCGAGTAGAAACAAGGCATTTTTTCA-3′,扩增目的片段长度约为2 300 bp;PB2F:5′-CCAGCRAAAGCAGGTCAAATATAT TCA-3′,PB2R:5′-TTAGTAGAAACAAGGTCGT TT T TAAACTA-3′,扩增目的片段约为2 300 bp。

反转录引物为通用引物Uni12:5′-AGCRAAAGCAGG-3′。上述引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒总RNA的提取 用T rizol方法从接种病毒的SPF鸡胚尿囊液中提取RNA,提取的RNA立即用于RT-PCR或于—20℃冻存备用。阳性对照为广西壮族自治区动物疫病预防控制中心家畜科实验室保存的H9N2禽流感亚型阳性鸡胚尿囊液,阴性对照为DEPC处理水。

1.2.2 RT-PCR 反转录反应体系为25 μ L:5×-M-MLV buffer 5 μ L,HIR,0.5 μ L,抑制剂MMLV,0.5 μ L,dNTPs(10 mmol/L)2 μ L,RNA 2 μ L。反应条件为:42℃1 h,95℃5 min。

PCR体系为25 μ L:10×E×Taq buffer 2.5 μ L,dNTPs2.5mmol/L2 μ L,MgCl2(25 mmoL/L)1.0 μ L,Taq DNA聚合酶(5 U/μ L)0.3 μ L,上下游引物(25 pmoL/μ L)分别加入0.5 μ L,加入12.5 μ L ddH2O补足。反应条件为:95℃5 min;95℃1 min,53℃1 min,72℃延伸1 min,35个循环;72℃10 min,4℃结束反应。

1.2.3 目的基因的回收、克隆及序列分析 PCR产物在10 g/L琼脂糖凝胶上进行电泳,可见到约为含2.3 kb的目的片段。按胶回收试剂盒说明书对目的DNA进行回收。将纯化回收的PB1、PB2的PCR产物与pMD18-T载体连接,连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,提取质粒,对酶切和PCR鉴定的阳性重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司测序;应用DNA Star软件与已知的H9N2毒株的PB2、PB1基因进行核苷酸和推导氨基酸比较,绘制进化树。

2 结果

2.1 RT-PCR结果

PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后,可见片段大小均约为2.3 kb的PB2和PB1特异性目的条带(图1和图2),大小与预期结果相符。

图1 PB2基因PCR产物Fig.1 PCR products of PB2 gene

图2 PB1基因PCR产物Fig.2 PCR products of PB1 gene

2.2 基因序列分析

2.2.1 PB2基因的同源性分析 测序结果表明,分离株鹅源H9N2 AIV的PB2基因为2 341 bp,完整的开放阅读框(ORF)由2 280个核苷酸组成,分别编码759个氨基酸,分离的鹅源H9N2病毒在关键的氨基酸位点第627位氨基酸为Glu,第701位氨基酸位Asp。将分离株与15个参考毒株的基因PB2基因进行同源性比较,其参考毒株CK/GX/14/00,GS/MN/57331/80、pfGS/Netherlands/1/06、Quail/HK/G1/97的核苷酸同源性较高,分别为98.2%、97.1%、97.1%和97.3%,推导氨基酸序列同源性为98.2%、97.1%、97.1%和97.3%。

2.2.2 PB1基因的同源性分析 测序结果表明,广西鹅源H9N2 AIV分离株的PB1基因为2 341 bp,完整的开放阅读框(ORF)分别由2 277个核苷酸组成,编码758个氨基酸,分离的鹅源H9N2病毒在关键的氨基酸位点第13位的推导氨基酸为Pro,678位氨基酸处为Ser。将分离株与16个参考毒株的PB1进行同源性比较,其参考毒株Bd/GX/82/05、CK/GX/14/00和Quail/HK/G1/97的核苷酸同源性较高,分别达到95.8%、94.0%和93.8%,推导氨基酸序列同源性分别为98.4%、97.2%和97.0%。

2.2.3 PB2、PB1基因的遗传进化分析 H9N2 AIV的遗传演化分为欧亚种系和北美种系,其中欧亚种系又分为3个群系,即DK/HKY280/97(第1亚群),QA/HK/G1/97(第2亚群)和DK/HK/Y439/97(第3亚群)。分离株PB2、PB1基因系统进化树分析显示,此株鹅源分离株与欧亚种系的第2亚群QA/HK/G1/97代表株的亲缘关系较近,属于欧亚种系第2亚群;与广西的鸡源CK/GX/14/00,鸟源Bd/GX/82/05的亲缘关系也较近(图3和图4)。

图3 PB2基因遗传进化树Fig.3 Phylogenetic tree of PB2 gene

图4 PB1基因遗传进化树Fig.4 Phylogenetic tree of PB1 gene

3 讨论

禽流感病毒在自然界的分布范围很广,除在家禽(鸡、鸭、鹅、火鸡、鸵鸟、鹌鹑等)能分离到病毒外,在野禽、海鸟等鸟类亦分离到病毒,野鸟是AIV的自然宿主[8]。水禽是AIV最复杂的生态系统,水禽与猪在AIV的遗传衍化及传播中发挥着重要作用[9]。而广西地处于亚热带的华南地区,气候潮湿温暖,水网密布,农村家养陆禽、水禽与猪混养的饲养方式普遍存在,增大了AIV在各种宿主之间的流行传播的风险。本研究采样鹅场附近广泛分布着农村散养户以及各中小型猪场,并从健康鹅分离到H9N2 AIV,开展了鹅源H9N2病毒各基因片段的测序及分析研究,初步了解广西鹅源禽流感的遗传演化关系,为加紧对广西地区禽流感病毒带毒监控与研究,对禽流感防控提供相关科学理论依据。

流行于世界各国禽群中的H9N2亚型禽流感病毒基本可分为北美及欧亚两种谱系。Li C J等[10]认为中国南方陆栖禽类中主要流行欧亚谱系中的两种亚系的H9N2亚型AIV,其中以CK/BJ/1/94或者DK/H K/Y280/97为代表的亚系主要流行于鸡群,另一亚系主要流行于鹌鹑,代表毒株为Qa/HK/G1/97。Guan Y等[11-12]对1996年—2002年分离的27株H9N2亚型AIV毒株的研究表明流行于中国内陆的H9N2亚型AIV源于CK/BJ/1/94。而本研究所分离到的鹅源H9N2 AIV与鹌鹑株Qa/HK/G1/97亲缘关系较近,与另一亚系代表株DK/H K/Y280/97亲缘关系较远。动物试验证明,鹌鹑更容易感染H9N2 AIV,而且可能是从禽类传染给人或哺乳动物的中间宿主[13],可以跨过种间屏障感染人类,对公共卫生安全构成严重威胁。本研究分离到的鹅源H9N2 AIV与广西一株鸟源H9N2 AIV同属于以鹌鹑源毒株为代表的第2亚群中,说明该亚群的H9N2病毒在广西的鹅或水禽中存在,对广西H9N2的发生与流行具有潜在的威胁。

Ohtsu Y等[14]研究发现,PB1蛋白与PA蛋白结合位点(1～25位残基)处的第13位氨基酸为Pro,与PB2蛋白结合位点(600～757残基)处的第678位氨基酸为Asn时,能够促进聚合酶亚单位与NP蛋白在新宿主环境中的相互作用,通过对聚合酶活性的调控来影响流感病毒对哺乳类动物的致病性。本研究分离株在13位的推导氨基酸为Pro,678位氨基酸处为Ser,有部分符合能够影响病毒对哺乳动物致病性的分子基础,但这种特征具体会对流感病毒的跨种间传播以及致病性产生怎样的影响目前还难以做出判断,需要进一步深入研究。

Hatta M等[15]认为,AIV PB2蛋白第627位氨基酸由Glu变成Lys能增强毒株对小鼠和人的致病性。李泽君等[16]研究发现,PB2蛋白第701位氨基酸由天冬氨酸(Asp)变为天冬酰胺(Asn)的毒株能提高毒株对小鼠的致病性。管轶等[17]认为PB2蛋白第714位氨基酸由Ser变为Ile或Gly时,病毒对哺乳动物的致病能力增强。本研究分离的鹅源H9N2病毒在第627位氨基酸为Glu,第701位氨基酸位Asp,表明其不具备对小鼠高致病性的禽流感病毒特征;而其第714位氨基酸为Ser,同样说明本毒株的低致病性特征。但在自然感染途径下,PB1、PB2某些氨基酸位点的突变可以减少对宿主的致病力[18]。因此,需要对AIV感染的分子基础及感染的分子机理进行更深入的研究。

[1] 甘孟侯.禽流感[M].北京:中国农业出版社,2000.

[2] 陈福勇.防控禽流感[M].北京:化学工业出版社,2004.

[3] Buttk M,Ganvian J D,Chen H L,et al.Human infection with an avian H9N2 influenza A virus in Hong Kong in 2003[J].J Clin Microbiol,2005,43(11):5760-5767.

[4] 柳 洋,鲁恩洁,王玉林,等.广州市禽类从业人群禽流感病毒感染特征分析[J].中华流行病学杂志,2009,30(11):1111-1113.

[5] 金元昌,李景鹏,张 龙,等.禽流感病毒分子生物学研究进展[J].动物医学进展,2003,24(1):12-15.

[6] 万春和,傅光华,程龙飞,等.A/Chicken/Zhejiang/HJ/2007(H9N2)禽流感病毒8基因测序及遗传进化分析[J].农业生物技术学报,2009,17(5):750-757.

[7] Nakagawa Y,Kimura N,Toyoda T,et al.The RNA polymerase PB2 subunit is not required for replication of the influenza virus genome out is involved in capped mRNA sythesis[J].J Virus,2002,29(2):728-733.

[8] Sharp G,Kawaoka Y,Wright S M,et al.Wild ducks are he reservoir for only a limited number of influenza A subtype[J].Epidemiol Infect,2005,110:161-176.

[9] 郑煦灿,焦培荣,单 芬,等.一株天鹅源H5N1亚型禽流感病毒的分离鉴定[J].动物医学进展,2010,31(5):5-8.

[10] Li C J,Yu K Z,Tian G B,et al.Evolution of H9N2 influenza viruses from domestic poultry in Mainland China[J].Virology,2005,340(1):70-83.

[11] Guan Y,Peris J S,Kong K F,et al.H5N1influenza virus isolated from geese in southeastern China:evidence for genetic reassortment and interspecies transmission to ducks[J].Virology,2002,292(1):16-23.

[12] Choi Y K,Ozaki H,Webster R J.et al.Continuing evolution of H9N2 influenza virus in southeastern China[J].J Virol,2004,78(16):8609-8614.

[13] Liu M,He S Q,David W,et al.The influenza virus gene pool in a poultry market in south central China[J].Virology,2003,305:267-275.

[14] Ohisu Y,Honda Y,Sakata Y,et al.Fine mapping of the subunit binding sites of influenza virus RNA polymerase[J].Microbiol Immunol,2002,46:167-175.

[15] Hatta M,Gao P,Halfmann P,et al.Molecular basis of high virulence of Hong Kong H5N1 influenza A viruses[J].Science,2001,293:1840-1845.

[16] Li Z J,Chen H L,Jiao P R,et al.Molecular basis of replication of duck H5N1 influenza viruses in a mammalian mouse model[J].J Virol,2005,79(18):12058-12064.

[17] Guan Y,Lipatov A S.Emergence of ultiple genotypes of H5N1 avian influenza viruses in Hong Kong SAR[J].Proc Natl Acad Sci,USA,2002,99:8950-8955.

[18] 杨彩然,董淑珍,杨宗泽,等.禽流感病毒致病性的分子基础研究进展[J].动物医学进展,2010,31(6):92-96.