张亚玉，宋晓霞，孙 海，汪景宽，于 树*

（1.中国农业科学院特产研究所，吉林 吉林 132109；2.沈阳农业大学土壤与环境学院，沈阳 110161）

野山参（Wild ginseng）为五加科人参属多年生草本植物，其根为道地中草药，吉林省东部山区被认为是人参最适宜的生长区，而抚松县被誉为“人参之乡”，自古就是人参的主产区，出产优质野山参。野山参是指自然生长在原始森林中，没有人为因素影响的一类人参。野山参的药用价值极高，早在2000年前，《神农本草经》中对野山参的药用价值就有了详细的记载，《本草纲目》中称野山参为“神草”，列为药中上品，具有生津安神、补虚固脱、大补元气、强精健身益寿延年之功效[1]。但随着对野山参无度采挖，导致目前野山参资源濒于灭绝的地步。而林下参和农田栽参的发展既是对山参资源的保护，又可满足人们对人参产品的需求，也为参农提供了治富之路，为农村产业结构调整提供了新的思路。但在林下参发展过程中由于选地不当，林下参的存苗率低，形体变劣的现象时有发生；农田栽参过程中由于改土不当，存在产量低、病害重，且存在严重的连作障碍，限制了参业的发展，而上述问题的产生均与土壤的物理、化学及微生物特性等关系密切[2-4]。通过对栽参土壤和老参地土壤的微生物及酶活性的研究，多数专家提出土壤微生物群落的改变可能是人参连作障碍的根源。野山参在深山密林中生长十年、几十年甚至上百年，其能够安然无恙，与其特有的土壤微生物群落特性直接相关。前人对于人参土壤微生物的研究多采用传统的培养法，由于可培养的微生物种类仅占土壤微生物的1%左右，所以对于微生物的真实性存在一定的误差，而磷脂脂肪酸PLFA方法是一种快速、重现性好的分析土壤微生物群落结构多样性的方法，可以分析所有活体微生物（包括可培养和不可培养的微生物）。而且，信息准确度高，应用范围广，操作简便，可以同时处理大量的样品，是对土壤中活体微生物的真实反映[5-8]。本文利用磷脂脂肪酸法通过对野山参根区土壤微生物结构特性与非根区土壤微生物群落的对比分析，明确山参根区土壤的微生物结构特征，期望能在农田栽参土壤改良和林下参护育选地方面提供帮助，为人参产业的健康发展提供指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

土壤样品采自吉林省人参之乡的抚松县露水河镇楞场村，离村5 km的黑熊沟山上，1号（大约12年生）野山参土壤位于东经127°44′、北纬42°47′、海拔（780±9）m，2号（大约25年生）野山参位于东经127°57′、北纬42°33′、海拔（650±5）m，采集地土壤类型为暗棕壤，该区是野山参经常被发现的地域。

1.2 采样方法

首先除去表面的枯枝落叶层后，边抬参边取土，由于野山参生长的特殊性，每年在生长期其须根周围均长出许多营养吸收根，枯萎期时有的脱落，有的在须根上形成珍珠点，使野山参根圈土壤可以扩展到须根周围2 cm左右的范围，对照为非根区土壤，在附近采集，采集深度与参层土壤样品相对应。取回的新鲜土样放入4℃的冰箱贮存待测。野山参根区土壤的基本性质见表1。

表1 供试土壤基本性质Table1 Some basic properties of tested soil

1.3 测试方法

土壤微生物磷脂脂肪酸的测定在White的方法[9]上加以改进。①鲜土加入柠檬酸缓冲液∶氯仿∶甲醇=0.8∶1∶2，25℃避光震荡，离心。再加入柠檬酸缓冲液∶氯仿∶甲醇=0.9∶1∶1，震荡，避光保存，经18 h分离后，用吸管把上层液吸走，保留底层氯仿相在氮气流下吹干。②用柱层析硅胶0.8 g（在120℃下烘干2 h）填充玻璃管柱（直径6 mm），依次分别加10mL氯仿、10mL丙酮、10mL甲醇，收集到的磷脂脂肪酸在甲醇相中，在氮气流下吹干样品。③向干样品中加入1mL甲醇∶甲苯（1∶1）混合液和1mL 0.2 mol·L-1KOH甲醇溶液，37℃水浴15 min后，冷却至室温，依次加入2mL去离子水，0.3mL 1 mol·L-1HAc，2mL正己烷，震荡，离心，甲酯化的C19:0为内标，氮气流下吹干，-20℃下保存。外标为SupelcoTM37 Component FAME Mix和Bacterial Acid Methl Esters Mix。

检测部分由安捷伦GC-MS（6890 N-5973 N）完成。色谱柱为hp5-MS（30 m×250 um×0.25 um）石英毛细管柱。GC-MS分析条件:升温程序:进样后在70℃保持5 min，之后以20℃·min-1的速率升至190℃，保持1 min，以5℃·min-1的速率上升到200℃，停留2 min，以10℃·min-1的速率上升到280℃，保留8 min。进样口温度为250℃，载气为He（0.9mL·min-1），分流比为 10∶1，离子源温度230℃，四极杆:150℃，质谱全扫描范围:30～600 m·z-1。

1.4 数据分析

应用Excel、SAS软件进行方差分析和PLFAs主成分分析。其中c、t、i和a分别表示顺势双键、反势双键、顺势支链、反势支链；br表示不确定支链位置，Me表示甲基位置，cy表示环丙基。结果见表2。

表2 磷脂脂肪酸的代表生物Table2 Biomarkers of some microbial groups in soil

2 结果与分析

本试验共测得1号土壤中的脂肪酸23种，2号土壤中脂肪酸19种，根区土壤与非根区土壤微生物所含脂肪酸种类基本相同。

2.1 野山参根区土壤的微生物PLFA图谱的特征

结果见图1、2。本研究鉴定的PLFAs，C链长度为14～24，包括饱和、不饱和、甲基化分支和环化脂肪谱，在野山参根区土壤的PLFAs中，i15:0，a15:0，i16:0，16:1w9c，16:1w9t，16:0，br17:0，i17:0，cy17:0，18:2w9，18:1w9c，18:1w9t等13种PLFAs在1号野山参土壤微生物丰度占97.28%，2号野山参中占84.89%，是山参根区土壤生态系统的主要生物成分。同时发现，野山参根区土壤微生物总量与非根区土壤微生物总量相比，均有下降的趋势。，野山参根区土壤的微生物组成也有所改变，对比所获得的野山参样品，1号野山参生长健康，无发病症状，研究1号根区土壤的微生物组成发现，根区中代表致病因素的真菌18:2w9，18:1w9c，18:1w9t的数量与对照相比明显减少，而代表放线菌种类的10Me17:0却明显增加；由于在人参生产中，真菌病害的发生较为常见，2号野山参虽然年限较长，但身体已经发生锈变的症状，可能与其根区土壤的微生物变化有着直接的关系，与对照相比，微生物的量虽然有减少的趋势，但代表真菌18:1w9c，18:1w9t减少的程度并不显著，有益微生物没有增加均在减少，这与农田土壤的微生物群落结构的变化与病害的发生直接相关相一致。

2.2 野山参根区土壤微生物的群落结构

通过PLFAs主成分分析可明显的区分野山参根区土壤与对照土壤（见图3），根区土壤在坐标轴附近，而对照土壤则远离坐标轴，说明野山参根区土壤微生物脂肪酸的组成和主成分一、二间的相关性不大或成负相关[12-13]。3个主成分得分解释了81.03%和85.44%的变异。主成分一（PC1）解释了36.54%和39.09%的变异，主成分二（PC2）解释了28.65%和29.91%的变异，主成分三（PC3）解释了15.83%和16.43%的变异，在测试的野山参根区土壤样品中，PC1得分均比对照低。主成分一、二的因子分析表明i15:0，a15:0，16:1w9c，i17:0与主成分一呈高度正相关，而16:1w9t，16:0，br17:0，17:0（10Me），cy17:0，18:0（10Me）18:2w9，18:1w9c，18:1w9t与主成分成高度负相关，也就是与根区土壤的微生物群落结构直接相关。从对两份土样的分析看，野山参生长根区土壤微生物群落组成发生了改变，尽管两份样品采自不同的山上，但根区土壤的微生物群落的变化却有相似的发展趋势。

图1 1号野山参PLFAs图谱Fig.1 PLFAs profile of tested No.1 soil

图2 2号野山参PLFAs图谱Fig.2 PLFAs profile of tested No.2 soil

图3 PLFAs主成分分析图谱Fig.3 Principle components analysis of PLFA profiles from microbe

3 讨 论

PLFAs在研究比较复杂环境中微生物群落组成方面应用广泛[14]，PLFAs的变化可以很好地反映野山参根区土壤微生物的变化，研究证明野山参根区土壤微生物脂肪酸图谱与对照相比发生明显的改变，野山参根区土壤的微生物总量明显减少，代表真菌生物的18∶2w9，18∶1w9c，18∶1w9t总量与对照相比有减少的趋势，这一结果有别与以往的相应研究。产生这一现象的原因可能与野山参的生长有直接关系，野山参在一地生长10年、20年甚至几十年，不感病，也不出现平地栽参的连作障碍，特有的根区土壤微生物群落特性可能是其健康生长的直接原因。

对于土壤微生物的传统培养方法，土壤微生物可培养的总量不足全部微生物的1%。分离结果不能够反映土壤微生物的真实情况，利用PLFA分析发法可以培养几乎土壤中全部的活体微生物，能够比较准确的反映土壤微生物的群落结构特征[15]，对野山参根区土壤所测得的23种PLFAs代表了土壤的细菌、真菌和放线菌，是野山参根区土壤生态系统的主要成分。结合以往对于栽培人参土壤微生物真菌培养研究的结果，在方法上为解决制约农田栽参和老参地的微生物改造方面提供了方法指导。由于野山参资源的濒临灭绝，其根区土壤的获得也较为珍贵，通过了解野山参根区土壤微生物群落特征，可以为农田栽参土壤改良提供科学指导。为人参产业持续健康发展提供新的理论支持。

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