张 军，刘玉洁，吉 丽，管建存，程 菲，张 倩

病态窦房结综合征(Sick sinus syndrome，SSS)是由于窦房结及其邻近组织器质性病变引起的窦房结起搏功能和(或)传导障碍，从而产生多种心律失常和临床症状的综合征，属心血管系统常见性、难治性疾病。我们在长期临床实践中，依据病态窦房结综合征临床表现，结合中医学理论及古代医家思想，组成升陷汤加味方治疗本病并取得了显著疗效。本实验拟通过升陷汤加味方预处理对兔病态窦房结综合征模型的影响来探讨其作用机制，为升陷汤加味方治疗病态窦房结综合征提供理论依据。

1 材料

1.1 动物

日本大耳白兔30只，华北煤炭医学院动物实验中心提供，体重2.5 kg～3.5kg，雌雄不拘，许可证SCXK(京)2007-0003。实验前实验性饲养5d。

1.2 试剂

25%乌拉坦，20%甲醛溶液，冰醋酸(分析纯)，Na+-K+ATP酶测试盒、SOD测试盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，4%多聚甲醛、梯度酒精(60%、70%、80%、90%、95%、1 00%)、香柏油、二甲苯、固体石蜡、苏木素染液、伊红染液。

1.3 主要仪器

BL－420生物机能实验系统(成都泰盟)，针形四极心电电极，自制棉签(2mm×2mm×3mm左右)，动物人工呼吸机DH－140(浙江医科大学仪器实验厂)，FA2004电子天平(上海天平仪器厂)，组织匀浆机(IKA-T8:Germany)，80-2离心沉淀器(江苏省金坛市医疗仪器厂)，SHZ-88水浴恒温振荡器(常州翔天实验仪器厂)，722S可见分光光度计(上海精密仪器有限公司)，切片机和光学显微镜。

1.4 药物

升陷汤加味方组成:黄芪 30g，知母 10g，柴胡6g，桔梗 10g，升麻 6g，党参 18g，山萸肉 20g，桂枝10g，炙甘草10g，羌活10g。采用广东一方制药有限公司生产的颗粒剂(相当于上述药物原生药饮片剂量);心宝丸(60mg/丸，星辰牌，广东真和新君宝药业有限公司)。

2 方法

2.1 分组、给药与造模

2.1.1 分组 将30只日本大耳白兔随机分成空白组(A组)、模型组(B组)、心宝对照组(C组)、升陷汤加味方高剂量组(D组)、升陷汤加味方中剂量组(E)、升陷汤加味方低剂量组(F组)6组，每组5只。

2.1.2 给药 每组于造模前先连续给药7d，每天1次，药物预处理组给药剂量按人与兔用药量换算方法［1］得出:A组:经口灌服蒸馏水15ml/d×7d;B组:经口灌服蒸馏水15ml/d×7d;C组:经口灌服心宝混悬液0.18g/kg.d×7d(与蒸馏水15ml/d制成混悬液);D组:经口灌服升陷汤加味方颗粒剂86.2g/kg.d×7d(溶于15ml/d蒸馏水);E组:经口灌服升陷汤加味方颗粒剂43.1g/kg.d×7d(溶于15ml/d蒸馏水);F组:经口灌服升陷汤加味方颗粒剂21.5g/kg.d×7d(溶于15ml/d蒸馏水);每组给药7d后进行模型制备手术。

2.1.3 模型制备 取健康大耳白兔30只，称重后用25%乌拉坦(1g/kg)经耳缘静脉麻醉，背位固定于动物手术台上，连接BL－420生物机能实验系统。颈部及胸前剪毛，消毒手术区。颈部气管切开备用连接呼吸机，沿胸骨右缘纵向切开皮肤长约2cm，打开胸腔，避免损伤右侧胸膜，经纵隔打开心包，充分暴露心脏。持续心电、呼吸监护。实验组用20%甲醛溶液浸湿大小约2mm×2mm×3mm棉签并置于窦房结区(上腔静脉与右心房交界处)［2］湿敷，连续监测心电图变化并记录其HR。空白组只行开胸手术，不行甲醛湿敷手术。以湿敷后HR较湿敷前下降30%以上或出现窦性停搏、窦房阻滞及(或)结性逸搏心律为窦房结组织急性损伤模型成功的标志［3］。当出现上述现象时即停止湿敷，对未出现上述现象者再持续湿敷5min，直到出现为止。

2.2 指标测定

2.2.1 心率的测定 记录造模前、模型制备成功后 5min、30min、60min、120min 基础窦性心率变化情况及空白组实验过程中相应各时间点的心率。

2.2.2 窦房结功能测定 窦房结恢复时间(SNRT)的测定:采用分级递增刺激法，以略大于基础心率的频率开始，之后以每次心率递增20%的频率分级刺激，直至SNRT不再延长为止。刺激时间为30s，间隔1min，刺激强度为2倍舒张域，脉宽0.3ms。计算方法:将心房刺激终止前的最后1个 P波至第1个恢复后的窦性P波时间为窦房结恢复时间，不论哪一个刺激频率水平，取其最大值作为每只兔的窦房结恢复时间。校正窦房结恢复时间(SNRTc)测定:SNRTc=SNRT－基础窦性周期长度(BCL)。窦房传导时间(SACT)测定:采用 Narula法［4］以大于基础心率10%的频率刺激右心房，连续8次，刺激强度、脉宽同 SNRT测定。计算方法:SACT=(刺激后恢复间期－基础窦性周期长度)/2。

2.2.3 心肌Na+-K+ATP酶测定 各组造模成功后2h，剪取心肌组织，迅速置于冰盐水中反复冲洗，滤纸吸干水分，准确称重0.2g，加入组织重量9倍的冰盐水，使用组织匀浆机1000r/min制成10%组织匀浆，1000r/min离心，取上清200μl用盐水按1∶4稀释成2%的组织匀浆，按试剂盒说明测定蛋白含量和Na+-K+ATP酶活力。

2.2.4 心肌SOD活力测定 取材及制备同Na+-K+ATP酶测定，取上清采用黄嘌呤氧化酶法，严格按试剂盒说明测定蛋白含量及SOD活力

2.2.5 窦房结病理切片观察 实验结束后剪取窦房结制作切片，光学显微镜观察各组窦房结组织损伤情况。

2.5 统计学处理

使用SPSS13.0统计软件，定量资料以均数±标准差(珋x±s)表示，多组间均数比较做单因素方差分析，重复测量数据采用重复测量资料方差分析，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组心率的变化情况

表1 各组心率的变化情况(珋x±s)(次/min)

表1显示，造模前与造模后比较(除A组外)，各组心率均下降30%以下(P<0.05)，且于60min、120min时趋于稳定，表明造模成功;与A组比较，B组、C组、D组、E组、F组造模后各时间点心率均下降(P<0.05);与B组比较，C组、D组、E组、F组造模后各时间点心率均上升(P<0.05);与C组比较，D组造模后各时间点心率下降不明显(P>0.1)，差异无统计学意义，E组、F组变化明显(P<0.05)。

3.3 各组心肌Na+-K+ATP酶活力、SOD活力的变化

表3 各组心肌Na+-K+ATP酶活力SOD活力的变化

3.2 各组窦房结电生理功能各项指标变化

表2 各组窦房结电生理功能各项指标变化(珋x±s)

表3显示，与A组比较，其余各组 Na+-K+ATP酶、SOD活力均显著降低(P<0.05);与 B组比较，C组、D组、E组、F组 Na+-K+ATP酶、SOD活力均升高(P<0.05);与C组比较，D组Na+-K+ATP酶、SOD活力变化不明显(P>0.1)，差异无统计学意义，而E组、F组变化显著(P<0.05)。

3.4 窦房结病理切片观察

表2显示，与A组比较，其余各组各项电生理时间均显著延长(P<0.05);与 B组比较，C组、D组、E组、F组各项电生理时间亦均显著缩短(P<0.05);与C组比较，D组各项电生理时间变化不显著(P>0.1)，差异无统计学意义，E组、F组各项电生理时间亦延长(P<0.05)。

观察结果显示，低倍镜(×100)下模型组及各用药组细胞肿胀，发生混浊变性，可见细胞排列紊乱，各组比较无明显差异。高倍镜下(×400)可见，细胞局灶性坏死，成纤维细胞增生，细胞排列紊乱。模型组大部分细胞都发生肿胀，细胞轮廓模糊，粒细胞浸润，部分细胞坏死，P、T细胞明显减少;用药组少量细胞肿胀，细胞轮廓模糊，P、T细胞数量较模型组多。

4 结果

4.1 升陷汤加味方具有提高兔病窦综合征模型心率的作用

观察实验组各时间点心率，与模型组比较，心宝组、升陷汤加味方高、中、低剂量组心率均显著上升。结果表明，心宝及升陷汤加味方均能提高和改善心率，而升陷汤加味方高剂量组较心宝组心率下降不显著(P>0.1)，中、低剂量组下降显著(P<0.05)，说明升陷汤加味方高剂量能提高心率，效果与心宝相当，且有剂量依赖关系。

4.2 升陷汤加味方可保护窦房结电生理功能

实验各组在造模后 SNRT、SACT、SNRTc与空白组比较均有延长(P<0.05)，表明各组因甲醛湿敷而造成窦房结功能不同程度的受损。实验结果显示，与模型组比较，各用药组SNRT、SNRTc、SACT均显著缩短，表明心宝及升陷汤加味方均能改善受损窦房结的自律性及其传导功能;与心宝组相比，升陷汤加味方高剂量组 SNRT、SNRTc、SACT略有延长(P>0.1)，而中、低剂量组延长显著(P<0.05)，提示升陷汤加味方高剂量具有与心宝相媲美的增强受损窦房结自律性及其传导功能的作用，亦说明其作用与剂量相关。

4.3 升陷汤加味方可提高兔病态窦房结综合征心肌Na+-K+ATP酶活力

Na+-K+ATP酶是细胞膜上普遍存在的一种离子驱动泵，在水解ATP的同时，能对抗细胞膜两侧电——化学梯度，维持膜内外 Na+、K+的浓度差［5］，在维持细胞的生理活动、细胞正常代谢及细胞内外离子平衡中起着重要作用。病态窦房结综合征患者常出现与心动过缓有关的心脏供血不足症状［6］，长时间心肌供血不足会导致心肌细胞膜受损，甚或不可逆性损伤。本实验在造模成功后2h剪取心肌组织并测定Na+-K+ATP酶活力。研究结果显示，与空白组相比，模型组、各用药组Na+-K+ATP酶活力显著降低，提示20%甲醛湿敷手术可能造成心肌细胞受损，各用药组较模型组Na+-K+ATP酶活力均明显升高，其中升陷汤加味方高剂量组与心宝组Na+-K+ATP酶活力相当，且高于升陷汤加味方中、低剂量组。此结果证实，升陷汤加味方确实能提高Na+-K+ATP酶活力，由此推断升陷汤加味方可能具有减轻心肌细胞损伤、保护心肌的作用，其深入性机制仍需进一步探讨。

4.4 升陷汤加味方可提高心肌SOD活力

心动过缓而致的心肌缺血缺氧，可产生氧自由基生成过多，使心肌受到损伤。SOD是体内清除氧自由基抗氧化酶系统的重要组成成分之一，它能清除超氧阴离子，阻断脂质过氧化链反应，保护细胞免受损伤［7］。SOD活性越高则清除超氧阴离子及抗氧化能力越强，保护的效果越显著。实验结果表明，与空白组比较，其余各组SOD活力均显著降低，表明心肌受损;与模型组比较，心宝组、升陷汤加味方高、中、低剂量组SOD活力显著升高，说明各用药组心肌具有自我保护能力;与心宝组相比，升陷汤加味方高剂量组SOD变化不显著，中、低剂量组SOD活力明显不及心宝组，因此升陷汤加味方高剂量具有更好的心肌保护效应。

4.5 升陷汤加味方可保护窦房结细胞形态结构

窦房结病理切片显示，模型组发生大量细胞肿胀，细胞轮廓模糊，粒细胞浸润，部分细胞坏死，P、T细胞明显减少;各用药组少数细胞肿胀，细胞轮廓模糊，P、T细胞减少数量较模型组少，表明用20%甲醛湿敷窦房结可以成功造成窦房结损伤模型，亦表明升陷汤加味方能够增强窦房结细胞抗损害的能力。

图1 使用升陷汤加味方后窦房结病理切片

图2 模型对照组窦房结病理切片

5 结论

病态窦房结综合征临床表现多为缓慢性心律失常，症见心悸、气短、胸闷、头晕甚至昏厥等，观其脉象常以迟缓为主，中医将其归属于“心悸”、“眩晕”、“胸痹”、“厥证”、“脉迟症”等范畴。根据多年的临床实践，我们认为本病的病机为大气下陷、胸阳不振。《素问·阴阳应象大论》:“气虚宜掣引之。”故大气下陷证的治疗当以升提胸中大气、振奋心阳为主，因此以张锡纯之升陷汤、张仲景的桂枝甘草汤作为基础方加减化裁为升陷汤加味方。本动物实验结果表明，升陷汤加味方预处理可提高兔病态窦房结综合征模型的心率，保护窦房结功能，提高心肌SOD、Na+-K+ATP酶活力和窦房结细胞抗损害能力，其功效与剂量相关，高剂量效果更佳，为本药的临床应用提供了科学依据 。

［1］ 刘福英，等.实验动物学［M］.北京:中国科学技术出版社，2005.209-210.

［2］ Boyett MR，Honjo H，Kodama I.The sinoatrial node，a heterogeneous pacemaker structure［J］.Cardiovasc Res，2000，47(4):658～687.

［3］ 耿乃至.复心脉方对病态窦房结综合征家兔模型 HR、SNRT、SACT影响的实验研究［D］.黑龙江中医药大学博士学位论文，2008.45.

［4］ Narula OS，Shantha N，Vasquez M，etal.A new meathod for measurement of sinoatrial conduction time.Circulation ，1978，58:706.

［5］ 徐桂芬，何英，等.参附注射液对缓慢性心律失常家兔心肌组织 Na+-K+ATP酶活性的影响［J］.中国中医药科技，2007，14(5):341-342.

［6］ 叶任高，陆再英.内科学［M］.北京:人民卫生出版社，2005.185.

［7］ 王迪浔，金惠铭主编.人体病理生理学［M］.北京:人民卫生出版社，2002.744-746.2.