赵兴梅，范春雷

(浙江中医药大学生命科学学院，杭州浙江 310053)

血管细胞黏附因子介导的血管炎性病变是很多疾病［如动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)［1］、风湿病、肾病等］共同的病理基础。研究发现［2］AS的血管壁中有VCAM-1的大量表达。过量表达的VCAM-1介导的炎症反应参与了AS发生发展的全过程［3］。儿茶素(catechin)是从茶叶中提取的酚类物质，有良好的调血脂抗AS作用。本实验以小鼠巨噬细胞RAW26.7为材料，考察儿茶素对oxLDL诱导［4］的巨噬细胞VCAM-1表达的影响，探讨儿茶素抗AS的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器小鼠巨噬细胞株RAW264.7，本实验室液氮储存。儿茶素标准品购自安徽甙尔塔天然有机化合物信息中心。oxLDL，本实验室制备。

1.2 实验方法

1.2.1 儿茶素对RAW264.7细胞增殖活性的测定 根据预实验，设儿茶素作用浓度分别为5、15、20、30 μmol·L－1;MTT 法检测不同浓度儿茶素对RAW264.7增殖的影响。

1.2.2 儿茶素对oxLDL诱导的巨噬细胞VCAM-1表达的影响设5个组:正常对照组，模型对照组和3个给药组。正常对照组:只加入5 ml完全培养液;模型对照组:加入5 ml完全培养液+终浓度为12 mg·L－1的ox-LDL;加药组:加入5 ml完全培养液+终浓度为12 mg·L－1的ox-LDL和终浓度分别为5、15、25 μmol·L－1的儿茶素。各组置体积分数为0.05的CO2，37℃培养箱培养24 h。分批提取细胞总RNA和细胞总蛋白后，通过实时荧光定量PCR法，Western blot法和ELISA法检测各组VCAM-1的表达量，具体方法如下:

实时荧光定量PCR逆转录为CDNA按照M－MLV(RNase H)逆转录试剂盒说明进行。引物:Sense:5'-GTTTGGCTCCAGACATTTACCC-3'，Anti-sense:5'-TGTAGTTCTTTGACAGTCTCCCTTTCTTT-3'，产物大小:246 bp。

用小鼠β-actin作内参基因(ref)。各组的目的基因和内参基因均做3个重复。按Bio Easy SYBR Green试剂盒说明进行。

1.3 数据分析各组实时定量PCR结果的Ct值计量资料数据用± s表示，以 2－△△Ct法进行基因表达量的半定量分析。Western blot检测VCAM-1蛋白的表达，利用凝胶成像系统对蛋白条带图像进行采集。ELISA检测VCAM-1的表达，按照Soluble mouse VCAM-1 ELISA Kit说明书进行。

2 结果

2.1 儿茶素对RAW264.7细胞增殖活性的测定MTT结果表明，与阴性对照组相比，儿茶素在 0 ～25 μmol·L－1内对RAW264.7的细胞增殖无影响，可以在这个浓度范围内研究儿茶素对RAW264.7细胞VCAM-1表达的影响。

2.2 儿茶素对oxLDL诱导的巨噬细胞VCAM-1基因表达的影响实时荧光定量PCR结果表明(Tab 1):model组与control组相比:VCAM-1基因表达量是它的581.59%，说明造模成功。5、15、25 μmol·L－1的 catechin 组与 model组相比:VCAM-1 基因表达量分别是它的18.56%、17.19%、11.99%。故5～25 μmol·L－1的儿茶素能抑制oxLDL对巨噬细胞VCAM-1基因表达的诱导作用，并且在5～25 μmol·L－1的浓度范围内存在量效关系。

2.3 儿茶素对oxLDL诱导的巨噬细胞VCAM-1蛋白表达的影响Western blot和ELISA(Tab 2)结果表明儿茶素能抑制ox-LDL对RAW264.7细胞VCAM-1基因表达的诱导作用。ELISA实验显示:模型对照组与正常对照组相比，P＜0.01。各给药组与模型对照组相比，P＜0.01。

3 讨论

多种炎性细胞因子的过度释放是AS形成的重要步骤［5］。VCAM-1主要存在于内皮细胞膜上，同时也表达于平滑肌细胞、巨噬细胞等［6］，受致炎因子刺激增加。它特异地与白细胞(除中性粒细胞外)所产生的Integrin家族的黏附因子VLA-4结合［7］，主要介导淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和内皮细胞的黏附和信号传递。

Tab 1 Effect of catechin on VCAM-1 mRNA expression induced by ox-LDL in macrophages(± s，n=3)

Tab 1 Effect of catechin on VCAM-1 mRNA expression induced by ox-LDL in macrophages(± s，n=3)

△△P＜0.01 vs control;＊＊P＜0.01 vs model

Group Ct(target) Ct(ref) △Ct △△Ct 2－△△Ct /%Control 13.19 ±0.16 12.39 ±0.18 0.80 ±0.25 0 100 Model 12.41 ±0.56 14.48 ±0.63 －2.06 ±1.02 －2.54△△ 581.59△△Catechin 5 μmol·L －1 13.13 ±0.12 12.76 ±0.40 0.37 ±0.29 2.43＊＊ 18.56＊＊Catechin 15 μmol·L －1 12.96 ±0.37 12.48 ±0.33 0.48 ±0.08 2.54＊＊ 17.19＊＊Catechin 25 μmol·L －1 13.32 ±0.28 12.26 ±0.11 1.06 ±0.28 3.06＊＊ 11.99＊＊

Tab 2 Effect of catechin on VCAM-1 expression induced by ox-LDL in macrophages detected by ELISA( ± s)

Tab 2 Effect of catechin on VCAM-1 expression induced by ox-LDL in macrophages detected by ELISA( ± s)

△△P ＜0.01 vs control，＊＊P ＜0.01 vs model

Group OD value( ± s)VCAM-1(pg)in 100 ng TP Control 0.126 ±0.003 0.080 ±0.003 Model 0.129 ±0.001 0.125 ±0.005△△Catechin 5 μmol·L －1 0.108 ±0.001 0.066 ±0.006＊＊Catechin 15 μmol·L －1 0.071 ±0.002 0.025 ±0.002＊＊Catechin 25 μmol·L －1 0.059 ±0.003 0.011 ±0.001＊＊

本实验检测了儿茶素对小鼠巨噬细胞VCAM-1表达的影响，结果显示5～25 μmol·L－1的儿茶素均能抑制oxLDL对巨噬细胞VCAM-1表达的诱导作用，并且在5～25 μmol·L－1的浓度范围内存在量效关系。儿茶素能降低oxLDL诱导的巨噬细胞VCAM-1的表达，这可能是其发挥抗AS药效的又一机制。

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