刘 义，吴昆鹏，杨巧珠，李延平，崔 燎

(1.广东天然药物研究与开发重点实验室;2.广东医学院第一临床学院，广东湛江 524023)

小分子肽(KP)是应用本实验室的中国发明专利技术(公开号:CN101015580)制备得到的一种小分子多肽，其相对分子质量为189～512u，具有水溶性强、生物活性强、结肠吸收率高的等特点［1］。体内实验显示KP能很好地预防骨质疏松［2］，但其作用机制还不明确。骨质疏松症防治药物临床前有效作用研究，除需骨质疏松动物模型作药效评价外，还需包含对成骨细胞形成促进有效或对破骨细胞吸收抑制有效的药效研究［3］，而NF-κB信号通路在骨质疏松症发生和发展过程中起着关键的作用。因此，本实验以小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1为研究对象，通过多个指标来衡量KP对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响，并结合NF-κB表达的变化，初步探讨KP在发挥防治骨质疏松中促成骨作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 仪器二氧化碳培养箱(HERAcell 150i，USA)，ELX800 酶标仪 (Bio-tek instruments Inc，USA)，Milli Q A10 超纯水器(Millipore Inc，USA)，恒温水浴锅(上海实验仪器厂)，55P 72超速离心机(日本日立公司)，恒温震荡培养箱(哈尔滨东联仪器厂)，DHG 9036A干燥箱(上海精宏实验设备仪器厂)，垂直板电泳仪(北京六一厂)，转移电泳槽(美国伯乐)。

1.2 药物和制剂KP由广东天然药物研究与开发重点实验室提供，胎牛血清(杭州四季青公司)，总蛋白提取试剂盒、Bradford蛋白定量试剂盒、增强型ECL化学发光检测试剂盒(BestBio)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、上样缓冲液、预染蛋白质分子量标准(碧云天生物技术研究所)，小鼠抗NF-κB p50、p60单克隆抗体、HRP标记羊抗小鼠二抗(Santa Cruz)，Dulbeccos modified Eagles medium培养基(DMEM，Gibco-BRL)，对硝基苯磷酸二钠、噻唑蓝、胰蛋白酶、β-甘油磷酸钠、茜素红均为Sigma公司产品，其余试剂为国产分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 MC3T3-E1细胞复苏后，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM将细胞接种于培养瓶中，在37℃、5%二氧化碳及饱和湿度条件下培养。每3天更换1次培养液。细胞长满后，用0.25%胰酶消化后传代。

1.3.2 MTT法检测细胞增殖 调整细胞密度为5×108·L－1，接种于 96 孔板，每孔 100 μl，24 h 后，换含不同浓度KP的DMEM培养液培养，药物浓度分别为0.01、0.1、1、10、25、50、100 mg·L－1，对照组为不含KP的DMEM培养液，每组设8个重复孔。继续孵育24、48、72 h，于细胞培养终止前每孔加入MTT(5 g·L－1)，孵育4 h后。吸出孔内上清液，每孔加入150 μl DMSO，振荡 20 min，在570 nm 波长处检测各组吸光度(OD值)。

1.3.3 PNPP法检测细胞中碱性磷酸酶的活性 调整细胞密度为5×108·L－1，接种于96孔板，每孔100 μl，24 h后，换含不同浓度KP的DMEM培养液培养，药物浓度分别为 0.01、0.1、1、10、25、50、100 mg·L－1，对照组为不含KP的DMEM培养液，每组设8个重复孔，药物作用 9、12、15、18 d后，去除培养液，用PBS清洗3次，然后每孔加入150 μl PNPP反应液(含有 25 mmol·L－1乙二醇胺、1 mmol·L－1氯化镁和 6.7 mmol·L－1PNPP)。37℃避光孵育0.5 h后每孔加入100 μl的 0.1 mg·L－1氢氧化钠终止反应，用酶标仪在405 nm波长处测定OD值。

1.3.4 紫外分光光度法检测细胞中羟脯氨酸的含量 细胞按1×108·L－1接种于24孔板，每孔1 ml。24 h后，换含不同浓度KP的DMEM培养液培养，药物浓度分别为0.01、0.1、1、10、25、50、100 mg·L－1，对照组为不含KP的DMEM培养液，每3天换培养液并加药，每组设3个重复孔，药物作用12、24 d后，去掉培养液，PBS冲洗3次，每孔加入浓度为150 g·L－1的三氯醋酸 1 ml，4℃放置 18 h，然后收集细胞于1.5 ml的Eppendoff管中，500×g离心5 min，去除上清液，沉淀用 6 mol·L－1的盐酸在110℃水解24 h，挥干盐酸后用三蒸水复溶，按照羟脯氨酸测定试剂盒说明书的要求操作，测定羟脯氨酸含量。

1.3.5 Alizarin red染色检测矿化结节 调整细胞密度为1 ×108·L－1，接种于 24 孔板，每孔 1 ml，24 h后，换含不同浓度KP的DMEM培养液培养，药物浓度分别为50、100 mg·L－1，对照组为不含 KP的DMEM培养液，每组设3个重复孔。药物作用30 d后，吸去培养液，用PBS冲洗3次，经0.04甲醛于室温下固定15 min，再用双蒸水冲洗2遍，加入的茜素红染色液，室温孵育20 min并轻微振荡，吸弃未结合的染料，用双蒸水漂洗并振荡5 min，重复4次，倾斜放置2 min，吸弃多余的双蒸水，倒置显微镜观察拍照记录。

1.3.6 Western blot检测细胞中 NF-κB p65、p50 的表达 调整细胞密度为5×108·L－1，接种于培养瓶中，24 h后，换含不同浓度KP的DMEM培养液培养，药物浓度分别为 50、100 mg·L－1，对照组为空白的DMEM培养液。孵育 3、12、24、30 d。提取总蛋白并进行蛋白定量，用β-actin做内参，SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离蛋白，然后电转移至PVDF膜，封闭后分别先加p65、p50抗体，二抗孵育后再加辣根过氧化物酶显色，然后在暗室中加ECL进行X线胶片曝光，再描测灰度值。

2 结果

2.1 KP对MC3T32-E1细胞增殖的影响各浓度KP对MC3T32-E1增殖无明显地抑制作用，25、50、100 mg·L－1KP 作用 MC3T32-E1 细胞 24、48、72 h后均能促进其增殖(P＜0.01)，结果如Fig 1。

Fig 1 The effect of KP on the cell growth of MC3T3-E1( ± s，n=8)

2.2 KP对MC3T32-E1细胞碱性磷酸酶的影响结果如 Fig 2:100 mg·L－1KP 在作用细胞 9、12、15 d后，能提高 MC3T32-E1细胞 ALP活性(P＜0.01);50 mg·L－1KP仅在9、12 d表现出此项作用(P ＜ 0.01);其他浓度(0.01、0.1、1、10、25 mg·L－1)均无增高MC3T32-E1细胞ALP活性的作用。

Fig 2 The effect of KP on the ALP activity of MC3T3-E1( ± s，n=8)

2.3 KP对MC3T32-E1细胞羟脯氨酸活性的影响不同浓度的KP作用于MC3T32-E1细胞12、24 d后，结果(Fig 3)显示 50、100 mg·L－1KP 能提高细胞中羟脯氨酸的含量(P＜0.01);其他浓度(0.01、0.1、1、10、25 mg·L－1)均无此作用，但也无减少其含量的作用。

Fig 3 The effect of KP on hydroxyproline content of MC3T3-E1(±s，n=6)

2.4 KP对MC3T32-E1细胞矿化作用的影响A-lizarin red染色检测矿化结节结果如Fig 4显示:KP作用于MC3T3-E1 30 d后，与空白组比较，50、100 mg·L－1KP能明显促进MC3T32-E1的矿化，骨结节数量明显增多，并与剂量成正比。

Fig 4 Photographs of 30-day bone nodules in KP-treated cultures of MC3T3-E1 cells(×200)

2.5 KP 对 MC3T32-E1 细胞中 NF-κB p65、p50表达的影响50、100 mg·L－1KP 在 3、12、24、30 d均能不同程度地抑制 MC3T32-E1中 NF-κB p65、p50蛋白的表达(P＜0.01)，见Fig 5。

3 讨论

小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1细胞株具有体外培养成骨细胞的各种生物学特性，是一株良好的体外培养成骨细胞株，已成为国内外公认研究药物对成骨细胞影响有价值的体外细胞型［4－5］。我们以前的研究显示KP能明显增加去卵巢大鼠的骨钙含量，使骨密度增加，能很好地预防骨质疏松症的发生，但对其在成骨过程中的作用还不了解。国外研究表明，在卵巢切除的大鼠骨质疏松模型中，NF-κB在成骨细胞中异常的活化。正常情况下，雌激素与雌激素受体结合能抑制NF-κB的表达，在卵巢切除的骨质疏松模型中由于缺乏足够的雌激素与雌激素受体结合导致 NF-κB 的异常活化［6－7］。因此本实验以MC3T32-E1细胞为研究对象，检测KP在整个成骨增殖、分化、矿化过程中对细胞的影响，同时探讨在此过程中KP对MC3T3-E1 NF-κB活性的影响。

在骨形成过程中，成骨细胞的增殖分化可分为成骨细胞增殖期、细胞外基质成熟期及细胞外基质矿化期3个不同的阶段，每个阶段都有特定的标志物。

成骨细胞增殖期是以细胞的增殖为特征。我们的实验结果显示KP对MC3T32-E1无细胞毒作用，不抑制其增殖;同时中、高浓度的KP能明显促进MC3T3-E1增殖，特别是 50、100 mg·L－1KP作用24、48、72 h后(P ＜0.01)，见 Fig 1。这证实 KP 是一种低毒且促增殖的生长促进因子。

在细胞外基质成熟期，能明显的检测到ALP和Ⅰ型胶原蛋白活性的特异性升高。ALP是反映成骨细胞分化早期活性的特异指标，ALP在成骨细胞分化早期处于一个上升的过程，在此过程中其表达的多少能反映出成骨细胞的分化程度和功能状态。我们的实验结果表明100 mg·L－1KP作用于MC3T3-E1 9、12、15 d能明显促进其 ALP活性(P ＜0.01)，见Fig 2;Ⅰ型胶原蛋白是成骨细胞分泌的一种基质蛋白，作为骨胶原的重要组成部分为细胞外基质矿化提供支架，其反映了成骨细胞分化中期的活性。而羟脯氨酸是衡量Ⅰ型胶原蛋白价值的重要指标，通过检测细胞中羟脯氨酸的含量能间接的反映细胞中Ⅰ型胶原蛋白的含量。50、100 mg·L－1KP在作用MC3T3-E1 24 d后能明显地提高细胞中羟脯氨酸的含量(P＜0.01)，见Fig 3。因此，在MC3T3-E1分化成熟的早期和中期KP都能提高其分化的活性，促进骨的形成。

Fig 5 Anaysis of p65，p50 and β-actin protein expression in MC3T3-E1 by Western blot(n=3)

在细胞外基质矿化期，是以骨结节的形成及数量为特征。骨结节是分化成熟成骨细胞形成多层叠加的结节样结构，同时骨结节是衡量成骨细胞分化晚期活性的指标。50、100 mg·L－1KP能够促进30 d MC3T3-E1的骨结节形成(Fig 4)，从而反映KP对分化晚期的成骨细胞也有促进作用。

而NF-κB信号通路在成骨细胞的增殖分化和凋亡过程中都有着重要的作用［8］。目前研究发现，骨质疏松时，T细胞和其他细胞高度表达炎症细胞因子如:TNF-α、IL-6、IL-1等，能促进成骨细胞中NF-κB 活化［9］，活化的 NF-κB 同时能促进 TNF-α、IL-6、IL-1 的转录，使其表达增加［10］，NF-κB 与炎症细胞因子形成一个循环放大的过程。大量NF-κB的活化，能够抑制多个成骨关键因子(如:Runx2、osterix、ALP、骨涎蛋白、Ⅰ型胶原蛋白)的表达和细胞外基质的矿化［11］，从而使骨形成受到抑制，导致骨质疏松症的发生。我们的Western blot检测结果显示，KP能够明显抑制MC3T3-E1不同生长时期(3、12、24、30 d)的 NF-κB p50 和 p65 蛋白的表达(P ＜0.01)(Fig 5)。

上述实验结果表明，KP在促进成骨细胞增殖、成骨基质蛋白ALP和I型胶原蛋白特异氨基酸(羟脯氨酸)表达、矿化结节的形成的同时能抑制MC3T3-E1细胞不同生长时期的NF-κB p50和p65蛋白表达。因此，我们推断KP促进MC3T3-E1细胞的增殖分化可能是通过抑制NF-κB信号通路来实现的。

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