沈 雁，吕 宾，张 烁，马忠俊

(1.浙江中医药大学附属第一医院消化内科，浙江 杭州 310006;2.浙江大学药学院现代中药研究所，浙江 杭州 310058)

结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤，在世界范围内，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势［1-2］。鉴于其早期诊断策略尚不成熟，以及放化疗毒副作用所造成的临床应用限制，因此研发传统中药材中潜在高效的抗癌活性成分不失为对抗结肠癌的一个新选择。

温郁金是姜科姜黄属植物温郁金Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling的干燥块根。研究表明，它具有降脂、护肝、抗肿瘤、抗辐射等广泛的药理活性［3］。近年来，温郁金的抗肿瘤效应日益受到关注:研究发现其多种提取液在体内外均能抑制胃癌的形成和发展;其醇提物中的姜黄素和其醚提物中的榄香烯已被证实为显效的抗癌成分。在此基础上，笔者进一步从其醚提物中分离得到另一种全新的二萜类化合物C。本实验拟观察该化合物C对人结肠腺癌SW620细胞增殖、凋亡的影响及相关信号通路蛋白表达及活性的变化，来阐述其抗癌作用的生物学机制，为寻找有效的结肠癌治疗药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和仪器温郁金二萜类化合物C由浙江大学药学院现代中药研究所分离提供［4］，其分子量为380，分子式为C22H36O5。

5-氟脲嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)注射液由天津金耀氨基酸有限公司提供(批号:0910221，分子量:130.08)。Leibovitz’s L-15 培养基及 0.25% 胰酶均为杭州吉诺公司产品;胎牛血清购自北美Gibco公司;MTT(噻唑蓝)干粉购自Ameresco公司;AnnexinV/PI凋亡试剂盒购自Biouniquer公司;兔抗p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、caspase-3 及β-actin均为Cell Signaling公司产品;抗兔二抗及抗鼠二抗为Jaskson公司产品。CO2培养箱(Thermo)、生物安全操作柜(Thermo)、流式细胞仪(BD)、离心机(Thermo)、电泳仪(BD)、半干半湿转膜仪(BD)等用于本实验。

1.2 实验细胞系和培养条件人结肠腺癌细胞(SW620)株购自中国科学院院上海细胞库，生长于含10%胎牛血清的L-15培养基中，置37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中常规培养。实验时取对数生长期细胞。

1.3 噻唑蓝还原法(MTT法)检测细胞增殖抑制情况细胞传代并接种于96孔培养板中，每孔10 000个细胞，200 μl，孵育 24 h 后吸弃上清液，每孔加入含化合物C的L-15培养液200 μl，使终浓度分别为10、20、40 和 70 mg·L-1;设阴性对照组(仅培养液干预)和空白对照组(不含细胞的血清培养基)，阳性对照组每孔加入含5-Fu的培养液200 μl，使其终浓度同化合物C(每个剂量设3个重复孔)。继续孵育24、48和72 h，实验终止前4 h添加5 g·L-1的 MTT液20 μl后再培养4 h，弃上清并加入DMSO 150 μl，上微量振荡器振荡 10 min，立刻用酶标仪测定吸光度值(A)，检测波长为570 nm。计算细胞生长抑制率。抑制率/%=［(阴性对照组A-空白对照组A)-(实验组A-空白对照组 A)］/(阴性对照组A-空白对照组A)×100%。

1.4 FCM检测细胞凋亡情况细胞培养并接种于中号培养皿中，每个培养皿6×105·L-1，3 ml，培养24 h后换成含化合物C的培养液3 ml干预，设40、55、70 mg·L-13个终浓度的实验组及阴性对照组，阳性对照组为相同浓度梯度的5-Fu组，每组重复3次。培养12、24、48 h和72 h后，用不含EDTA的胰酶消化细胞，PBS漂洗 2次(2 000 r·min-1，5 min)，并用 500 μl的 Binding buffer悬浮细胞，再加入5 μl Annexin V-FITC混匀，室温、避光、反应5～15 min后，上机检测。

1.5 Wester blot检测蛋白表达将对数生长期细胞 1 ×106个分别以 0、40、55、70 mg·L-1化合物 C作用48 h后，用0.25%胰酶消化、PBS漂洗，再加入150 μl新鲜配置的 RIPA裂解液，放冰上裂解30 min，4℃ 12 000 r·min-1离心 10 min，收集上清液，用Bradford法测定蛋白含量;各浓度组的蛋白均取30 μg，加等体积上样 Buffer混合，100℃变性 5 min后，以每孔20 μl的上样体积加入12%的分离胶和5%的浓缩胶中进行SDS-PAGE电泳，之后用半干半湿转膜仪250 mA电转2.5 h将蛋白转移到PVDF膜上;用含 5%BSA 的 TTBS(0.1%Tween-20，10 mmol·L-1Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol·L-1NaCl)4℃封闭过夜;分别用抗 ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK、caspase-3、β-actin 的一抗和相应二抗孵育，TTBS洗膜3次，每次10 min;最后用增强化学发光法(ECL)检测阳性信号，显影后根据彩色标准电泳指示条带(marker)中的位置来分析各电泳条带的性质。

1.6 统计学分析数据用SPSS 17.0统计软件包分析，结果用±s表示，两组间均数比较用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Least-Significant Difference(LSD)法。

2 结果

2.1 MTT测定结果二萜类化合物C及5-Fu在10、20、40 和70 mg·L-1的终浓度时对 SW620 细胞的增殖均呈时间-浓度依赖性的抑制作用(Fig 1);化合物C作用24、48和72 h后的半数有效抑制浓度(IC50)分别为 29.75、15.91 和 6.55 mg·L-1;各时间段、各浓度的化合物C对SW620的抑制率均较同时间、同浓度的5-氟脲嘧啶为高(P＜0.01)。

2.2 FCM测定结果两种药物均能不同程度地诱导SW620细胞发生凋亡，其中化合物C的促凋亡效应呈明显的时间-浓度依赖性(Fig 2);作用12 h，40和55 mg·L-1化合物C组与同浓度5-FU组的凋亡率间比较，差异无统计学意义;此外各时间段、各浓度时，化合物C的促凋亡作用均强于5-FU(Tab 1，P ＜0.01)。

Tab 1 Apoptosis rate of SW620 cells induced by diterpenoid C and 5-FU(±s，n=3)

Tab 1 Apoptosis rate of SW620 cells induced by diterpenoid C and 5-FU(±s，n=3)

＊＊P ＜0.01 vs 5-Fu group;▲▲P ＜0.01 vs control group

Concentration/mg·L-1 Diterpenoid C/%5-FU/%.04 ±0.842 40 5.40±0.374▲▲ 15.66±0.459▲▲＊＊ 34.22±1.317▲▲＊＊ 50.71±1.803▲▲＊＊ 4.14±0.500▲▲ 8.63±0.551▲▲ 9.11±0.565▲▲ 44.72±1.461▲▲55 9.08±0.906▲▲ 42.11±0.930▲▲＊＊ 61.83±0.794▲▲＊＊ 88.54±2.273▲▲＊＊ 11.40±0.816▲▲ 17.94±1.010▲▲ 44.30±1.855▲▲ 56.53±1.881▲▲70 28.15±1.090▲▲＊＊67.80 ±0.931▲▲＊＊ 81.40±1.692▲▲＊＊ 98.20±0.910▲▲＊＊ 18.25±0.641▲▲ 35.89 ±1.235▲▲ 63.38±0.245▲▲ 82.76 ±1.981 12 h 24 h 48 h 72 h Control 0.35±0.085 3.17 ±0.285 4.01±0.721 9.04±0.842 0.35±0.085 3.17 ±0.285 4.01±0.721 9 12 h 24 h 48 h 72 h▲▲

2.3 Western blot检测结果与阴性对照组相比，化合物C干预组的ERK、JNK及p38 MAPK的表达水平均受到抑制;而三者相应的磷酸化水平，即p-ERK、p-JNK和p-p38的表达则受到更为明显的抑制;相反，caspase-3的蛋白量则呈上调趋势(Fig 3，P＜0.01)。上述蛋白的抑制/活化效应均表现出剂量依赖性的特点。

3 讨论

结肠癌的发生发展是一个多基因参与、涉及多阶段演变的复杂过程。在外界致癌信号的过度刺激下，相关转导通路中关键效应子发生异常的激活/失活，引起下游原癌基因和抑癌基因的表达失衡，进而导致肠上皮细胞表型的转变。癌转的细胞能逃避生理性凋亡点的监控而达到永生化，同时还获得对周围组织、器官的高侵袭力。因此，诱导肿瘤细胞凋亡将是治疗结肠癌的一条积极有效的途径［5］。

温郁金是临床常用的传统中药材，目前国内外对其有效成分的研究主要集中于姜黄素和榄香烯，并已证实这两种成分具有良好的抗癌活性［6-8］。我们的前期研究结果显示，［9-11］温郁金的水提物、醚提物和醇提物在体内外均能抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖，且后两者尚具有良好的凋亡诱导效应，其作用机制可能与下调血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、环氧合酶-2(cycloxygenase-2，COX-2)的水平以减少瘤灶内微血管密度(microvessel density，MVD)、提高血浆和组织中生长抑素(somatostatin，SS)的表达、抑制胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)Ⅰ和Ⅱ的分泌等有关。为深入了解并开发温郁金中潜在的其他抗癌活性成分，我们成功地从其醚提物中提取出一种新型二萜类化合物C，其化学结构和性质都有别于姜黄素和榄香烯。通过本次实验发现，该化合物C能以时间-浓度依赖性的方式抑制人结肠腺癌SW620细胞的增殖，并诱导凋亡，从而逆转癌细胞本身存在的生长失控、凋亡失能特性，表现出高效的抗癌活性，且其对结肠腺癌细胞的毒性作用明显高于临床上常用的化疗药物5-Fu。

丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路是细胞信号转导网络中的重要成员之一，它能通过高度保守的“瀑布样”磷酸化级联反应将细胞外刺激与细胞内基因表达和胞质功能活动连接起来，参与细胞的增殖、分化、运动、凋亡等多种生命活动。目前在哺乳动物细胞中鉴定出了3条主要的亚通路，即细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular-signal regulated kinase，ERK)通路、c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)/应激活化蛋白激酶(stress activated protein kinase，SAPK)通路和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)通路，已被证实在包括结肠癌在内的多种消化系肿瘤中存在异常表达或活化，提示其与肿瘤的发生发展间存在密切联系［12-14］。其中ERK通路主要接受有丝分裂原的刺激，活化后能促进细胞增殖、分化、骨架重构等，与肿瘤细胞的恶性生物学行为间关系密切［15］;JNK和p38通路则主要接受各种应激和病理性损伤信号，有时也可被有丝分裂原所活化，产生的效应在很大程度上取决于信号类型和(或)自身亚型的不同，可以表现为促进凋亡或抵抗、修复损伤这两种截然相反的结果［16］。Caspase-3是凋亡经典通路的下游蛋白元件，被活化后则成为最关键的凋亡执行者，能促进绝大多数凋亡事件的开启［17］。我们的实验结果显示，化合物C能浓度依赖性地抑制ERK、JNK和p38的水平，而对三者磷酸化的抑制程度更为显著;相反，它能明显诱导活性caspase-3的蛋白表达。推测化合物C可通过下调ERK通路介导的分裂生存效应、抑制JNK/p38通路介导的细胞保护效应，同时传递活化信号至凋亡效应子caspase-3，进而诱导人结肠腺癌SW620细胞发生凋亡。

Fig 1 Inhibitory effects of diterpenoid C and 5-FU on the proliferation of SW620 cells(±s，n=3)

Fig 2 Flow cytometry analysis for apoptosis of SW620 cells induced by diterpenoid C( ± s，n=3)

Fig 3 Effects of diterpenoid C on MAPK signaling pathway and caspase-3 in SW620 cells treated for 48 h(±s，n=3)

综上所述，温郁金醚提物中的二萜类化合物C是一种新型的抗癌活性成分，其诱导的人结肠腺癌细胞凋亡可通过抑制MAPK存活途径、激活caspase-3凋亡途径而实现。本研究结果在一定程度上展示出温郁金醚提物中二萜类化合物C在结肠癌临床治疗中的广阔前景，并将为后续更为深入的系列研究奠定理论基础。

［1］ Jemal A，Tiwari R C，Marray T，et al.Cancer statistics 2004 CA cancer［J］.J Clin，2004，54:8-29.

［2］ Maroun J，Ng E，Berthelot J M，et al.Lifetime costs of colon and rectal cancer management in Canada［J］.Chronic Dis Can，2003，24:91-101.

［3］ 方露敏，黄 真.温郁金的研究进展［J］.中华中医药学刊，2008，26(9):1998-2000.

［3］ Fang L M，Huang Z.Research progress of Radix curcumae［J］.Chin Arch Tradit Chin Med，2008，26(9):1998-2000.

［4］ Ma Z J，Meng Z K，Zhang P.Chemical constituents from the radix of Curcuma wenyujin［J］.Fotiterapia，2009，80(6):374-6.

［5］ 梁 磊，张绪慧，王晓燕，等.槐定碱对人结肠腺癌细胞株 SW 620增殖和凋亡的影响［J］.中国药理学通报，2008，24(6):782-7.

［5］ Liang L，Zhang X H，Wang X Y，et al.Effect of sophoridine on pro-liferation and apoptosis of human colon adenocarcinoma cells(SW620)［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(6):782-7.

［6］ Li X，Wang G，Zhao J，et al.Antiproliferative effect of beta-elemene in chemoresistant ovarian carcinoma cells is mediated through arrest of the cell cycle at the G2-M phase［J］.Cell Mol Life Sci，2005，62:894-904.

［7］ Xie C Y，Yang W，Li M，et al.Cell apoptosis induced by delta-elemene in colorectal adenocacinoma cells via a mitochondrial-mediated pathway［J］.Yakugaku Zasshi，2009，129(11):1403-13.

［8］ 刘晓真，张宏颖.姜黄素与肿瘤细胞作用的分子机制［J］.大连医科大学学报，2008，30(5):465-8.

［8］ Liu X Z，Zhang H Y.Molecular mechanism of effect of curcumin on tumor［J］.J Dalian Med Univ，2008，30(5):465-8.

［9］ 俞林峰，吕 宾，徐 磊，等.温郁金对饮用MNNG大鼠胃黏膜血管内皮生长因子和环氧合酶-2表达的影响［J］.胃肠病学，2007，12(3):140-3.

［9］ Yu L F，Lü B，Xu L，et al.Effects of curcumae on expressions of vascular endothelial growth factor and cyclooxygenase-2 in gastric mucosa of rats fed with MNNG［J］.Chin J Gastroenterol，2007，12(3):140-3.

［10］徐 毅，吕 宾，项柏康，等.温郁金对鼠血浆和胃组织生长抑素水平的影响［J］.中国中西医结合消化杂志，2004，12(4):222-4.

［10］ Xu Y，Lü B，Xiang B K，et al.Effect of extract of radix curcumae on somatostatinin plasm and gastric tissue［J］.Chin J Integr Trad West Med Dig，2004，12(4):222-4.

［11］何必立，吕 宾，徐 毅.温郁金对胃癌细胞的抑制作用及其对IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ表达的影响［J］.世界华人消化杂志，2004，12(11):2761-3.

［11］ He B L，Lü B，Xu Y.Inhibition of common turmeric on human gastric caicinoma cell line SGC-7901 and its effect on the expression of insulin-like growth factorⅠ，insulin-like growth factorⅡ and vascular endothelial growth factor［J］.World Chin J Digestol，2004，12(11):2761-3.

［12］ Wang W，Wang X，Peng L，et al.CD24-dependent MAPK pathway activation is required for colorectal cancer cell proliferation［J］.Cancer Sci，2010，101(1):112-9.

［13］ Guo K，Liu Y，Zhou H，et al.Involvement of protein kinase C betaextracellular signal-regulating kinase 1/2/p38 mitogen-activated protein kinase-heat shock protein 27 activation in hepatocellular carcinoma cell motility and invasion［J］.Cancer Sci，2008，99(3):486-96.

［14］ Mishra P，Senthivinayagam S，Rangasamy V，et al.Mixed lineage kinase-3/JNK1 axis promotes migration of human gastric cancer cells following gastrin stimulation［J］.Mol Endocrinol，2010，24(3):598-607.

［15］周四桂，袁 茜，潘雪刁，等.ERK1/2和p38 MAPK介导 BAPTA-AM抑制RANKL诱导小鼠骨髓巨噬细胞分化的机制研究［J］.中国药理学通报，2010，26(9):1146-50.

［15］ Zhou S G，Yuan X，Pan X D，et al.ERK 1/2 and p38 MAPK mediate the effect of BAPTA-AM inhibiting RANKL-induced bone marrow macrophages differentiation［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(9):1146-50.

［16］文 军，徐 明.p38 MAPK激酶抑制剂增强二烯丙基二硫化物诱导CNE2细胞凋亡［J］.中国药理学通报，2003，19(4):418-23.

［16］ Wen J，Xu M.Inhibition of p38 MAPK kinase enhances diallyl disulfide-induced apoptosis in human CNE2 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2003，19(4):418-23.

［17］ Mouratidis P X，Colston K W，Dalgleish A G.Doxycycline induces caspase-dependent apoptosis in human pancreatic cancer cells［J］.Int J Cancer，2007，120(4):743-52.