何金花，陈顺仪，王 莉，陈武嘉，黄俊杰，蒋建伟

(1.广东省广州市番禺中心医院检验科，广东 广州 511400;2.暨南大学医学院生化教研室，广东 广州 510630)

研究表明，消化系肿瘤的发病与肿瘤细胞凋亡的减少有密切关系。通过诱导肿瘤细胞使其重新恢复凋亡，比杀死肿瘤细胞更符合人体生理性细胞死亡过程，可以明显减少或消除当前治疗药物所导致的毒副作用。因此，诱导肿瘤细胞凋亡已成为肿瘤研究的一个热点。凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)编码一组结构相关的蛋白质，能抑制Caspase依赖的细胞凋亡途径。在人类发现的 IAPs家族有8个成员，其中 survivin、xiap、BRUCE/apollon、livin是其中的主要成员，抑制细胞凋亡作用较强［1］。因此人们提出IAPs家族基因可能是肿瘤治疗的分子靶点。

目前有一些靶向采用 survivin、xiap、apollon、livin基因的反义核酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASO)或siRNA抑制肿瘤细胞增殖的实验文章，但是，在IAPs家族的这些基因中反义抑制哪个基因的表达效果更好呢，尚未见这方面的实验报道。为此本文拟采用 survivin、xiap、apollon、livin反义核酸作用于人肝癌、结肠癌、胃癌细胞，比较它们对细胞的增殖与凋亡的作用，为消化系肿瘤基因治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1.1 主要试剂及细胞 DMEM/F12培养基购自Gibco公司，脂质体 LipofectamineTM2000、Annexin VPI双染试剂盒购自美国BD公司，CCK-8(Cell Count Kit-8)试剂购自日本同仁化学研究所。人肝癌HepG2细胞、胃癌 MGC-803细胞、结肠癌Lovo细胞由本实验室提供。

1.1.2 反义核酸 4条IAP家族各成员反义核酸序列均是文献［2－5］已经证实能高效特异性抑制靶基因表达，由赛百盛生物工程技术服务有限公司合成，全硫代修饰，PAGE纯化，冻存于－20℃，使用前用无血清的DMEM/F12培养液配制成100 μmol·L－1的浓度备用。反义核酸及随机寡核苷酸序列如下，见Tab 1。

Tab 1 Sequence of antisense oligodeoxynucleotide of targeting gene

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 人肝癌HepG2细胞、胃癌MGC-803细胞、结肠癌 Lovo细胞培养体系:DMEM/F12培养液含10%新生牛血清，置37℃、5%CO2培养箱，每2～3天用0.25%胰蛋白酶消化传代培养。实验选用对数生长期、台盼蓝拒染率＞95%的细胞。实验时按照脂质体lipofectamineTM2000(μl)∶ASO(μg)为 2.5∶1的比例配制，先用DMEM/F12液分别将脂质体和ASO稀释至等体积，室温孵育5 min，然后将脂质体与ASO在室温下混合20 min，再将混合物逐滴加入细胞培养板中。

1.2.2 WST法检测3种肿瘤细胞的增殖抑制 取对数生长期的HepG2、MGC-803和Lovo细胞，用含10%新生牛血清的DMEM/F12培养液调细胞浓度为4×107个·L－1，接种到96孔板。12 h后，吸尽上清，更换为无血清DMEM/F12培养液。将配好的脂质体与ASO混合物逐滴加入到孔板中，ASO的作用浓度分别设为 0.1、0.2 μmol·L－1。将细胞培养板放置培养箱培养5 h后，每孔加入含10%小牛血清的培养液继续培养。另设空白对照组(control)、随机寡核苷酸对照组(RODN，终浓度为0.2 μmol·L－1)。48 h 后，每孔加入 CCK-8 试剂10 μl，室温孵育90 min，多功能酶标仪(Bio-Rad)测定吸光度A450nm(激发波长450 nm，参比波长655 nm)，计算细胞的增殖抑制率。细胞增殖抑制率/%=(对照组吸光度－实验组吸光度)/对照组吸光度×100%。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI双染色法检测肿瘤细胞的细胞凋亡水平 取对数生长期细胞，调细胞浓度为 1 ×108·L－1，接种于 12 孔板，总体积 1 ml，12 h后加入药物，设①control组，②RODN组(终浓度0.2 μmol·L－1)，③ASO 组(终浓度 0.2 μmol·L－1)等3组，培养48 h后，消化收集细胞，以染色缓冲液(binding buffer)重悬，加入FITC标记的AnnexinV试剂和PI试剂，混匀后避光孵育15 min，加入200 μl染色缓冲液，立即使用流式细胞仪检测，AnnexinV-FITC+，PI–的细胞群(即LR细胞群)为早期凋亡细胞。

1.2.4 统计分析 应用SPSS13.0统计软件处理数据，计量资料以±s表示，采用完全随机设计的单因素方差分析(one-way ANOVA)分析组间差异的显著性。

2 结果

2.1 4种ASOs对肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用IAPSASO作用于HepG2细胞48 h后，浓度为0.1、0.2 μmol·L－1的 ASO 可抑制细胞的增殖，随着ASO浓度的增高，对细胞的增殖抑制率越高，抑制率明显高于RODN组(P＜0.01)，并呈剂量依赖效应。其中，在作用浓度为 0.2 μmol·L－1时，survivin ASO、xiap ASO和apollon ASO对 HepG2细胞的增殖抑制的作用最强，抑制率超过80%(Tab 2)。

Tab 2 Effect of the 4 ASOs on the proliferation inhibition of HepG2 cells(±s，n=3)

Tab 2 Effect of the 4 ASOs on the proliferation inhibition of HepG2 cells(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs control respectively，##P ＜0.01 vs RODN respectively，－:not detected.IR:inhibitory rate

Group 0.1 μmol·L －10.2 μmol·L －1 A450 IR/%A450 IR/%Control 1.764 ±0.034 0 1.764 ±0.034 0 RODN － － 1.567 ±0.024 11.22 ±1.67 survivin ASO 0.464 ±0.017 74.13 ±0.93＊＊ 0.279 ±0.025 84.23 ±1.38##livin ASO 0.618 ±0.014 65.03 ±0.78＊＊ 0.379 ±0.009 77.51 ±0.47##xiap ASO 0.441 ±0.013 75.04 ±0.77＊＊ 0.297 ±0.020 83.23 ±0.85##apollon ASO 0.503 ±0.015 71.50 ±0.83＊＊ 0.327 ±0.023 81.54 ±1.26##

2.2 4种ASOs对胃癌MGC-803细胞的增殖抑制作用IAPSASO作用于MGC-803细胞48 h后，浓度为0.1、0.2 μmol·L－1的 ASO 可抑制细胞的增殖，随着ASO浓度的增高，对细胞的增殖抑制率越高，抑制率明显高于RODN组(P＜0.01)，并呈剂量依赖效应。其中，在作用浓度为0.1 μmol·L－1时，xiap ASO抑制MGC-803细胞增殖的作用最强;在作用浓度为 0.2 μmol·L－1时，xiap ASO 和 survivin ASO对MGC-803细胞的增殖抑制作用最强，抑制率超过80%(Tab 3)。

2.3 4种ASOs对结肠癌Lovo细胞的增殖抑制作用IAPSASO作用于Lovo细胞48 h后，浓度为0.1、0.2 μmol·L－1的 ASO 均可明显抑制细胞的增殖，并呈剂量依赖效应。其中，在作用浓度为0.1 μmol·L－1或 0.2 μmol·L－1时，均以 survivin ASO抑制细胞增殖的作用最强;在作用浓度为0.2 μmol·L－1时，survivin ASO对结肠癌细胞的增殖抑制率超过80%(Tab 4)。

Tab 3 Effect of the 4 ASOs on the proliferation inhibition of MGC-803 cells(±s，n=3)

Tab 3 Effect of the 4 ASOs on the proliferation inhibition of MGC-803 cells(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs control respectively;##P＜0.01 vs RODN respectively，－:not detected.IR:inhibitory rate

Group 0.1 μmol·L －10.2 μmol·L －1 A450 IR/%A450 IR/%Control 1.632 ±0.029 0 1.632 ±0.029 0 RODN － － 1.480 ±0.029 9.08 ±1.43 survivin ASO 0.851 ±0.035 50.14 ±2.10＊＊ 0.304 ±0.051 81.40 ±2.92##livin ASO 0.939 ±0.036 42.50 ±1.88＊＊ 0.399 ±0.032 75.66 ±1.92##xiap ASO 0.422 ±0.020 74.22 ±1.13＊＊ 0.221 ±0.035 86.56 ±2.27##apollon ASO 0.994 ±0.016 39.09 ±0.92＊＊ 0.591 ±0.016 63.79 ±0.98##

Tab 4 Effect of the 4 ASOs on the proliferation inhibition of Lovo cells(±s，n=3)

Tab 4 Effect of the 4 ASOs on the proliferation inhibition of Lovo cells(±s，n=3)

＊＊P ＜0.01 vs control respectively，##P ＜0.01 vs RODN respectively，－:not detected.IR:inhibitory rate

Group 0.1 μmol·L －10.2 μmol·L －1 A450 IR/%A450 IR/%Control 1.684 ±0.056 0 1.684 ±0.056 0 RODN － － 1.565 ±0.009 7.22 ±0.67 survivin ASO 0.742 ±0.017 55.90 ±1.23＊＊ 0.292 ±0.006 82.61 ±0.35##livin ASO 1.011 ±0.018 39.80 ±1.24＊＊ 0.523 ±0.027 68.82 ±1.67##xiap ASO 0.894 ±0.029 47.84 ±2.24＊＊ 0.454 ±0.029 73.93 ±1.66##apollon ASO 0.871 ±0.035 48.28 ±2.47＊＊ 0.432 ±0.044 74.35 ±2.84##

2.4 4种ASOs对肝癌HepG2细胞凋亡的影响各组药物作用肝癌HepG2细胞48 h后，利用PI-Annexin V双染流式细胞术检测细胞早期凋亡率，左下限(LL)为正常细胞群，右下限(LR)为早期凋亡细胞群，右上限(UR)为晚期凋亡细胞及坏死细胞群。与 control组和 RODN组相比，livin ASO、survivin ASO、apollon ASO组细胞早期凋亡率大幅度增加，凋亡率分别为27.4%、19.8%、14.1%，晚期凋亡分别为 27.9%、22.5%、23.7%(Fig 1)。

2.5 4种ASOs对结肠癌Lovo细胞凋亡的影响各组药物作用于结肠癌Lovo细胞48 h后，利用PIAnnexin V双染流式细胞术检测细胞早期凋亡率。与control组和RODN组相比，4种ASOs均诱导结肠癌细胞凋亡。其中survivin ASO和livin ASO组细胞早期凋亡率大幅度增加，细胞凋亡率分别为34.9%、33.3%，apollon ASO和xiap ASO组也有一定的促凋亡作用，凋亡率为19.4%、15.9%;晚期凋亡方面，xiap ASO组细胞晚期凋亡和坏死率最高，为40.9%，livin ASO和survivin ASO组细胞晚期凋亡和坏死率分别为27.1%和23.1%(Fig 2)。

2.6 4种ASOs对胃癌MGC-803细胞凋亡的影响各组药物作用胃癌MGC-803细胞48 h后，其早期凋亡率高于control组和RODN组，其中apollon ASO促进细胞凋亡的作用最强达41.1%，各组坏死率大于凋亡率，可能与细胞状态有关(Fig 3)。

Fig 1 Effect of IAPs ASO on the induction of apoptosis in HepG2 cells

Fig 2 Effect of IAPs ASO on the induction of apoptosis in Lovo cells

Fig 3 Effect of IAPs ASO on the induction of apoptosis in MGC-803 cells

3 讨论

细胞凋亡又称为程序性细胞死亡，在机体发育分化和维持体内平衡中起着十分重要的作用，受细胞内源性基因酶类和信号传导途径的调控。凋亡受抑制将导致细胞生存期延长，并使损伤的或基因突变的细胞继续生长，最终导致肿瘤的产生［6］。IAPs(inhibitor of apoptosis proteins)是从杆状病毒中分离出，此后在酵母、昆虫、人和其它哺乳动物组织中都有发现，是具有抗凋亡作用的蛋白家族，目前共发现IAP 家族中有 XIAP、c-IAP1、c-IAP2、NAIP、Apollon、Livin、Survivin、ILP-2等8个成员。IAP主要有3个结构域，即BIR、RING、CARD结构域，其中BIR结构域全称为杆状病毒重复序列，为IAP家族抑制细胞凋亡所必需，所有家族成员至少含有1个BIR结构域，而凋亡抑制蛋白发挥功能是与它密切相关［6］。

xiap基因定位于染色体Xq25，N末端有3个BIR，C末端有1个 Ring指结构域［7］。survivin基因位于染色体17q25，在胚胎和发育的胎儿组织中广泛表达，在终末分化的成人组织中不表达，而在人类各种肿瘤组织中广泛表达。彭万仁等［8］研究丹皮酚抑制肝癌细胞增殖凋亡的影响，其机制可能与下调 XIAP，Survivin蛋白有关。Chen等［9］发现，人脑瘤SNB-78细胞有apollon基因的高表达，显示对多种化疗药物不敏感。采用apollon反义核酸抑制Apollon蛋白的表达，明显提高SNB-78细胞对cisplatin和喜树碱的敏感性，Apollon蛋白对SNB-78细胞具有抗凋亡作用［10］。

本研究选取IAPs家族中抑制凋亡作用较强的4 种蛋白 Survivin、Xiap、Apollon、Livin，通过合成其反义寡核苷酸序列，运用脂质体转染肝癌细胞，胃癌细胞、结肠癌细胞。WST实验结果显示:在作用浓度为 0.2 μmol·L－1时，4 种反义核酸对 HepG2、MGC-803、Lovo细胞增殖均有很强的抑制作用，其中survivin、xiap、apollon反义核酸抑制 HepG2细胞增殖的作用最强，survivin、xiap反义核酸抑制 MGC-803细胞增殖的作用最强，survivin反义核酸抑制Lovo细胞增殖的作用最强。

流式细胞术检测细胞凋亡实验显示，各组药物作用于HepG2细胞48 h后，各组细胞早期凋亡率大幅度增加，其中livin反义核酸致HepG2细胞凋亡作用最强，达27.4%;apollon ASO和survivin ASO组也有一定的促凋亡作用，凋亡率为14.1%、19.8%;同时以livin、apollon和survivin ASO组细胞晚期凋亡和坏死率较高，xiap ASO对HepG2细胞致凋亡作用较其他3种反义核酸弱。

各组药物作用于Lovo细胞48 h后，各组细胞早期凋亡率大幅度增加，其中livin ASO和survivin ASO致细胞早期凋亡作用最强，分别达33.3%和34.9%;apollon ASO和xiap ASO组也有一定的促凋亡作用，凋亡率为 19.4%、15.9%;同时以 xiap ASO、livin ASO和survivin ASO组细胞晚期凋亡和坏死率较高，分别为40.9%、27.1%和23.1%。

各组药物作用于MGC-803细胞48 h后，各组细胞早期凋亡率增加，其中apollon ASO和livin ASO致细胞早期凋亡作用最强，分别达41.1%和35.6%;以xiap ASO组细胞晚期凋亡和坏死率最高。

对肝癌HepG2细胞，xiap ASO的增殖抑制效果很好，而致细胞凋亡作用一般，可能是因为xiap ASO还通过其他方式致细胞死亡，如细胞自噬性死亡或直接导致细胞坏死，这还有待于今后进一步证明。IAPs家族不同的基因的反义核酸对两种肿瘤细胞增殖抑制、致凋亡水平有差异，是由于不同蛋白在不同组织中表达水平不同，而且这些蛋白虽然属同一家族，结构上同源，但在功能上还是有区别的。以靶向 survivin、xiap、apollon、livin 的反义核酸或 siRNA作用于消化系肿瘤细胞，抑制细胞的增殖，诱导细胞的凋亡，将为临床治疗消化系肿瘤提供理论依据。

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