张鹤琼，吴世芬，黄巨恩，李校堃

(1.广西医科大学护理学院，广西南宁 530021;2.温州医学院生物与天然药物研究院，浙江温州 325027)

无论是机械性损伤或药物化学刺激性损伤血管壁，都会造成血管内皮细胞损伤，导致各种血栓性疾病的发生。顺铂(cisplatin，DDP)是一种广谱、有效的抗癌药物，尽管其肾毒性是临床应用受限的主要因素，但其血管毒性也不容忽视，王现珍等［1］近期研究表明大鼠在高血压发病过程中，体内各级动脉内皮细胞均发生损伤，大动脉内皮细胞功能损伤出现早且程度高于中、小动脉，因此探索如何保护血管内皮细胞，是医学研究的热点。黄巨恩等［2］通过建立庆大霉素损伤的肾模型探讨了酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor，aFGF)的保护作用。受此启发，本研究开展DDP的血管内皮细胞损伤模型，观察aFGF的保护作用，并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂d 1～3 SD大鼠10只，由广西医科大学实验动物中心提供。低糖D氏改良Eagle培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)为美国Gibco公司产品;胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)为杭州四季青生物工程材料有限公司产品;胰蛋白酶为美国Amerco公司产品;DDP为山东齐鲁制药有限公司产品;aFGF由暨南大学生物工程研究所提供(批号20050618);兔抗人Ⅷ因子相关抗原(Ⅷ-R Ag)多克隆抗体为中杉金桥公司产品;3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)为美国 Sigma公司产品。

1.2 实验方法和步骤

1.2.1 肺微血管内皮细胞的分离培养 动物酒精消毒后断头置于无菌盘内，分层解剖暴露胸腔，从右心室灌注PBS液至双肺发白，取出肺组织，剪取胸膜下肺表面1～2 mm厚组织块，粗剪漂洗，细剪后加入细胞培养液洗涤离心，沉淀物重悬后接种于预先铺有明胶的玻璃培养瓶中翻转培养，37℃、5%CO2培养箱固定2 h后正转，加入少量培养液使组织块湿润，次日补加培养液至适量。

1.2.2 细胞的传代培养及种板 原代细胞培养7～9 d后，细胞融合成单层，占满瓶底的80%以上，PBS液洗涤后加入0.25%胰蛋白酶消化2～5 min，显微镜下观察，细胞连接松解变圆且部分漂离瓶底时终止消化，吸管吹打使细胞脱落，离心后弃去上清，加入培养基重新分瓶用于细胞鉴定或细胞计数接种于96孔板用于后期实验。

1.2.3 血管内皮细胞的鉴定 使用兔抗人Ⅷ因子相关抗原(Ⅷ-R Ag)多克隆抗体和SP试剂盒，按SP染色法进行，PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.2.4 实验分组与药物处理 空白和对照组设6个复孔，每个DDP浓度设4个复孔，实验重复3次。(1)空白组:20%FBS的DMEM培养基。(2)对照组:细胞+20%FBS的DMEM培养基。(3)DDP组:与对照组无异，24 h后加入一系列浓度的DDP，使其终浓度依次为 100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 3 mg·L－1。(4)aFGF+DDP 组:在一系列浓度 DDP的基础上同时加 aFGF 10 μg·L－1［3］。24 h 后加入二甲基亚砜，酶标仪 492 nm 波长检测各孔光密度值。

1.3 统计学方法用Bliss法计算各组半数抑制浓度(50%inhibiting concentration，IC50)，采用 SPSS 13.0 for Windows统计学软件统计分析，计量资料数据以±s表示，两组间均数比较用t检验。

2 结果

2.1 原代血管内皮细胞的培养与鉴定种瓶后36 h换液，去除漂浮的组织块和血细胞，60～72 h可见组织块周围内皮细胞游出(Fig 1)，剔除组织块，换液继续培养。7d左右可见细胞基本融合成片，呈现明显的上皮样细胞形态，以短梭形或多角形为主，边界清晰，大小均匀，外观呈铺路石样或鹅卵石样镶嵌状排列生长(Fig 2)。经Ⅷ因子多克隆抗体免疫细胞化学染色，可见染色阳性的细胞质出现分布较均匀的棕黄色颗粒，胞核不显色而呈紫蓝色(Fig 3、4)。

Fig 1 After 60 h endothelial cells free out(100×) Fig 2 Primary cultured vascular endothelial cells on d 7(100×) Fig 3 Cells identified by immunocytochemistry ofⅧfactor related antigen(100×) Fig 4 Cells identified by immunocytochemistry ofⅧfactor related antigen(400×)

2.2 DDP对血管内皮细胞的毒性及aFGF的拮抗效应随着DDP浓度的增加，细胞生长抑制率升高，加入一定浓度(10 μg·L－1)的 aFGF 后，细胞生长抑制率相应减少(Tab 1)。根据Tab 1中各组不同药物浓度下相应的细胞生长抑制率，用Bliss法通过SPSS 13.0统计学软件可计算出各组半数抑制浓度(IC50)(Tab 2)。结果显示:10 μg·L－1浓度的aFGF可减弱DDP对血管内皮细胞的损伤，相应致使IC50值增高，可见aFGF具有一定的保护作用。

Tab 1 The influence of aFGF at the concentrations of 10 μg·L －1 on growth inhibitory rate of vascular endothelial cells( ± s，n=4)

Tab 1 The influence of aFGF at the concentrations of 10 μg·L －1 on growth inhibitory rate of vascular endothelial cells( ± s，n=4)

DDP/mg·L－1 Inhibitory rate of cell growth after DDP and aFGF were added DDP 10 μg·L －1aFGF+DDP 100 0.9179 ±0.0790 0.9012 ±0.1178 50 0.9109 ±0.1018 0.8904 ±0.0861 25 0.8821 ±0.0330 0.8633 ±0.0873 12.5 0.8260 ±0.0451 0.7983 ±0.0913 6.25 0.6669 ±0.0759 0.6103 ±0.0852 3.125 0.5264 ±0.0830 0.4496 ±0.0952 1.5625 0.3323 ±0.0430 0.2838 ±0.0258 0.7813 0.2058 ±0.0448 0.1674 ±0.0155

Tab 2 The influence of aFGF at the concentration of 10 μg·L －1on the damage of vascular endothelial cells IC50caused by DDP( ± s，n=3)

Tab 2 The influence of aFGF at the concentration of 10 μg·L －1on the damage of vascular endothelial cells IC50caused by DDP( ± s，n=3)

*P＜0.05 vs DDP group

Group 24 h IC50/mg·L －1 DDP 2.5871 ±0.4597 10 μg·L－1aFGF+DDP 3.9763 ±0.1683*

3 讨论

建立体外培养的血管内皮细胞药物损伤模型，获取纯化的血管内皮细胞是先决条件。本研究通过多种尝试，发现肺微血管的组织块法最简单、快捷和经济;预先明胶铺瓶和倒置干贴壁可增加内皮细胞的贴壁率;体积分数20%胎牛血清则有利于细胞的爬出和较快的生长，而培养基中加入肝素可大大提高了内皮细胞的纯度。

DDP是一种广谱、有效的抗癌药物，通过抗增殖和细胞毒性发挥着直接抗肿瘤作用。因其强致吐性和严重的肾毒性、耳毒性、血管毒性，使其临床应用受到很大限制。近期的研究表明，DDP所致的肾毒性、耳毒性、神经毒性与其所致的微血管损害有关，其机制可能与顺铂在体内和体外对内皮细胞均有增殖抑制作用有关［4］。牟坤等［5］研究发现，低剂量DDP节律化疗体外有抑制血管内皮细胞生长、体内有抑制血管生成作用。可见，DDP很可能直接作用于内皮细胞而发挥其抑制和损伤作用。

aFGF是一种在体内分布广泛的生长因子，对中胚层和神经外胚层来源的组织细胞具有促进分裂增殖和损伤修复的作用。血管内皮细胞来源于中胚层，aFGF可与内皮细胞表面的FGF受体结合，发挥其对细胞损伤的保护作用。黄巨恩等［6］通过动物体内、体外实验表明碱性成纤维细胞生长因子对细胞的酶活性有稳定和保护作用，故受电击后因对内皮细胞损伤有良好的保护作用而表现出一定的抗凝血作用。刘丽敏等［7］发现aFGF可促进体外培养的肾小管上皮细胞存活和增殖，并对DDP损伤的肾小管上皮细胞有明显的保护作用。但aFGF是否对DDP所造成血管内皮细胞的损伤具有保护作用，以及机制如何，尚少见文献报道。本实验通过体外原代培养血管内皮细胞，利用DDP建立损伤模型，借鉴章斌等［3］实验研究浓度，证明 10 μg·L－1浓度的aFGF可使DDP致伤的血管内皮细胞的IC50值升高，表明aFGF对DDP所造成的内皮细胞损伤有保护作用，可能与其抵消或削弱DDP的抑制作用而发挥促增殖和修复作用直接相关，至于深入的机制、更具体的浓度范围和对细胞酶活性以及自由基损伤指标的影响还需在后期的实验中进一步探讨。

［1］ 王现珍，蒋嘉烨，陆家凤，等.SHR高血压进程中不同类型血管内皮功能损伤及药物修复研究［J］.中国药理学通报，2010，26(2):163－8.

［1］ Wang X Z，Jiang J Y，Lu J F，et al.Study in the damage of endothelial function and administration recovery among different arteries during the developing progress of SHR［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(2):163 －8.

［2］ 黄巨恩，王慧杰，刘华钢，等.酸性成纤维细胞生长因子对庆大霉素诱导的肾小管上皮细胞损伤的保护作用［J］.中国药理学通报，2007，23(11):1455 －7.

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［3］ 章 斌，梅 举，张宝仁，等.酸性成纤维细胞生长因子促血管内皮细胞增殖作用的实验研究［J］.皖南医学院学报，2003，22(1):5－7.

［3］ Zhang B，Mei J，Zhang B R，et al.The experimental research on the proliferative action on rat aortic endothelial cells using acidic fibroblast growth factor［J］.Acta Acad Med Wannan，2003，22(1):5 －7.

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［7］ Liu L M，Liu H G，Huang J E，et al.Protective effects of aFGF on renal tubular epithelial cells damaged by cisplatin in vitro［J］.Anat Res，2006，28(4):243 －6.