李 航，段惠军

(河北医科大学1.组织学与胚胎学教研室、2.病理学教研室，河北石家庄 050017)

氧化应激产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)直接或间接地损伤细胞内蛋白质、脂质、核酸等大分子物质的生理功能，是众多疾病发生的病理生理基础。急性氧化应激包括缺血/再灌注、急性中毒等;慢性氧化应激包括癌症、神经变性疾病、动脉粥样硬化、糖尿病、衰老等。机体形成了一套复杂的氧化应激应答系统来应对自由基和有毒物质的损害:当暴露于亲电子试剂或活性氧刺激时，机体自身能诱导出一系列的保护性蛋白，以缓解细胞所受的损害［1］。这一协调反应是由保护性蛋白DNA上游调节区的抗氧化反应元件(antioxidant responsive element，ARE)来调控的。而近年来的研究发现，核因子NF-E2相关因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)通过与ARE相互作用调节编码抗氧化蛋白，是迄今为止发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路［2］。

1 Nrf2

Nrf2蛋白分子量66 ku，在肝脏、肾脏等解毒器官以及皮肤、肺和消化道等暴露于外环境中的器官高度表达。Nrf2是cap'n'collar(CNC)转录因子家族成员，共有一高度保守的碱性亮氨酸拉链(leucime zipper bZIP)结构［3］。研究证实，Nrf2含有6个高度保守的结构域，命名为 Neh 1～Neh 6［4］(Fig 1)。

2 Keap1

生理状态下，Nrf2在细胞质中与它的抑制蛋白果蝇肌动蛋白结合蛋白Kelch(Kelch-like ECH2 associated protein 1，keap1)结合，并通过Keapl蛋白将其锚定于由肌动蛋白构成的细胞骨架上，从而无法进入细胞核发挥转录活性［5］。对于Nrf2与Keap1的关系大多数学者的观点是:生理状态下，Keap1在细胞质内以二聚体的形式结合一个Nrf2分子，使之成为E3泛素连接酶的适配底物，促进Nrf2泛素化继而被26 S蛋白酶体降解。这样，在静息状态下，Nrf2就处于一种非游离并且不断降解的非活性状态;当受到亲电试剂或ROS的刺激时，Keap1与Nrf2解偶联使得Nrf2转移入核，与基因中的Maf蛋白结合成异二聚体后识别并结合ARE，启动下游保护性蛋白基因的转录，提高细胞抗氧化应激能力［6－7］。也有另外的观点:在细胞质中，Keap1二聚体的两个DGR区与Nrf2的DLG、ETGE区结合，并介导Nrf2的泛素化降解。当受到亲电子试剂或ROS的刺激时，亲和力较低的DLG区从DGR区解离，而ETGE区仍牢固地连接在DGR上，这样，Nrf2就不能被泛素连接酶识别，但是Keap1的位点仍被Nrf2占据，新生成的Nrf2由于Keap1的位点饱和而不能被Keap1结合，所以就会以游离状态源源不断地进入细胞核而发挥转录活性。这就是所谓的“门闩和枢纽”(latch and hinge)学说［8－9］(Fig 2)。

Fig 1［4］ Nrf2 regulatory network

3 Nrf2/ARE通路

ARE是一个特异的DNA-启动子结合序列，位于超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)等保护性基因的5'端的启动序列(5-GAGTCACAGTGAGTCGGCAAAATT-3)，这一序列能被多种氧化性和亲电性化合物激活，从而启动II相解毒酶和抗氧化酶基因的表达，保护细胞组织正常功能［10］。Nrf2是这一序列的激活因子。活化的Nrf2从Keap1解离后进入细胞核，在核内与Maf蛋白结合成异二聚体后与ARE序列结合，进而启动受ARE调控的基因的转录。这一表达路径被称为Nrf2-ARE通路［11］。有趣的是，Nrf2蛋白作为一种转录因子，也可以通过结合其自身基因5＇端的ARE序列，调节其蛋白的转录活性［12］。而且，有证据表明，激活的Nrf2-ARE信号通路可以抑制由泛素介导的Nrf2蛋白降解，稳定Nrf2蛋白在细胞质的浓度，增强Nrf2蛋白的转录活性［13－14］。这说明Nrf2的激活可以形成一种正反馈调节机制，进一步加强其调节保护性基因的转录活性。目前认为Nrf2是调控细胞对抗外来异物和氧化损伤的关键转录因子。Nrf2缺失或激活障碍，会引起细胞对应激源的敏感性增高。Nrf2-ARE通路在抗肿瘤、抗应激、抗凋亡、抗炎症反应、抗动脉粥样硬化以及调节心脑血管反应、神经保护等方面发挥着广泛的细胞保护功能。

Fig 2［8］ Schematic overview of the Nrf2-Keap1 cytoprotective pathway

4 Nrf2的激活

Nrf2从Keap1解离是Nrf2蛋白激活并发挥转录活性的关键步骤。Nrf2从Keap1解离有两种不同的机制:(1)亲核物质或ROS直接攻击作用。亲电子物质或ROS对Keap1的半胱氨酸残基进行修饰，引起Keap1的构象变化，进而导致Nrf2与Keap1解离，Nrf2稳定性增加并转入细胞核中与ARE结合，这是Nrf2最普遍的活化方式［15］。(2)磷酸化的间接作用。多种蛋白激酶可通过诱导Nrf2的磷酸化参与对Nrf2转录活性的调节。目前认为促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)［16］，蛋白激酶 C(PKC)和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)［17］等几条蛋白激酶途径参与了Nrf2-ARE激活和依赖其基因表达的调控。

5 Nrf2/ARE通路转录调节的抗氧化蛋白

Nrf2-ARE通路之所以重要是因为其激活后能够启动下游多种保护性基因的表达。到目前为止，已证实经Nrf2-ARE信号路径调节的可编码内源性保护基因超过200个。这些保护性基因包括抗氧化蛋白类基因、Ⅱ相解毒酶基因、分子伴侣类基因和抗炎因子类基因等。它们在增强组织抗氧化能力、保护组织免收毒物损伤、抗肿瘤、抗炎症、抗凋亡中起着重要的作用［18］。其中，作为Nrf2信号路径的主要调节蛋白，抗氧化酶类通过催化自由基转化为无毒物质和增加其水溶性利于自由基排除而发挥作用，是维持机体氧化还原平衡的重要因素［19］。多项研究发现，在Nrf2基因敲除小鼠的基础及诱导性抗氧化基因表达明显降低，而氧化应激损伤明显增强，提示Nrf2-ARE通路是调节细胞内氧化还原状态的关键。现将几种经Nrf2-ARE通路重要的抗氧化蛋白/酶介绍如下:

5.1 血红素氧合酶1(heme oxygenase 1，HO-1)。HO-1是血红素降解的限速酶，催化血红素生成等摩尔数的胆红素、CO和铁。近年研究发现，HO-1的抗氧化功能一方面与其阻止游离血红素参与氧化反应有关，另一方面，HO-1及其酶解产物胆红素、CO共同发挥着抗氧化、抗炎、抑制细胞凋亡和扩血管、改善组织微循环等作用，广泛参与心、脑、肺、肝、肾等组织细胞的抗氧化应激损伤，是机体最重要的内源性保护体系之一。通过对野生型和Nrf2－/－SD大鼠肝脏缺血/再灌注的研究中发现，肝脏缺血60分钟后再灌注时，野生型大鼠的肝脏枯否细胞被激活;肝脏、肾脏Nrf2、HO-1蛋白及mRNA水平明显增高;Nrf2核转位增加;血清肌酐清除率降低;而在Nrf2－/－大鼠则未出现以上保护作用［20］。李航等研究表明，1%tBHQ添加饲料喂养Ⅰ型糖尿病小鼠可以减轻糖尿病小鼠肾脏的氧化应激损伤，伴随着Nrf2蛋白的激活和核表达，其调控的抗氧化蛋白HO-1表达明显增强［21］。另有研究表明七氟烷可以通过激活Nrf2信号通路诱导大鼠海马神经元HO-1 mRNA表达［22］。以上结果表明，HO-1的表达增强由激活的Nrf2介导的。

5.2 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthethase，γ-GCS)γ-GCS是体内还原型谷胱甘肽(GSH)合成的限速酶，是一个由重链亚单位(γ-GCSh)和轻链亚单位(γ-GCSl)组成的二聚体。重链具有全酶的催化功能，轻链无催化活性，但对重链的活性起调节作用。增加γ-GCS的含量和活性，可以促进GSH的合成，增强组织细胞抗氧化应激的能力。研究表明ROS和外源性化学有毒物质能够通过激活Nrf2，上调γ-GCS的表达。喂给Nrf2+/+小鼠吡唑后，其肝脏γ-GCS、HO-1、谷胱甘肽S转移酶(GST)蛋白表达明显上调并可降低小鼠肝脏的氧化应激损伤，而Nrf2－/－小鼠无此作用［23］。Okouchi等［24］对高糖培养的人大脑内皮细胞(IHEC)进行研究，发现胰岛素可以通过激活PI3K/Akt信号通路促进Nrf2的核转位，上调γ-GCS蛋白表达，降低髙糖对IHEC的氧化应激损伤。

5.3 超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)研究证实［19］，白藜芦醇可以降低H2O2刺激引起的大鼠肝脏原代细胞氧化应激损伤，其作用是通过激活Nrf2，进而促进SOD表达介导的。给予Nrf2特异激活剂莱菔硫(500 μg·kg－1·d－1)预处理3 d后，对大鼠心脏进行缺血/再灌注损伤实验。发现莱菔硫烷治疗组心脏左室舒张末压(LVEDP)、左室形成压(LVDP)较对照组明显改善。心肌组织抗氧化蛋白Mn-SOD、HO-1、过氧化氢酶表达明显升高;而给予特异性抑制剂5-HD预处理3 d则作用相反［25］。此现象说明莱菔硫烷通过激活Nrf2下游的抗氧化蛋白的表达发挥着对大鼠心脏缺血/再灌注损伤的保护作用。

5.4 依赖还原型辅酶/Ⅱ醌氧化还原酶1(NADPH:quinone oxidoreductase，NQO1)NQO1是一种调节细胞内物质处于氧化还原状态的黄素酶，它以NAD(P)H为受体，催化醌类及其衍生物，使其失去2个电子，发生还原反应，其催化特性在于无单电子还原产物半醌及自由基等氧化产物形成，对各种代谢引起的氧化应激反应具有保护作用。染色体免疫沉淀分析证实Nrf2结合于NQO1基因的ARE序列，并激活NQO1蛋白的表达［26］。以治疗剂量的锌(100 μmol ZnCl2·kg－1·d－1)连续喂养小鼠4 d，可以明显减轻庆大霉素对大鼠肝功能损害，增加肝脏苯琨还原酶1(NQO1)含量;而增加程度与Nrf2蛋白表达增加呈现正相关［27］。有研究报道［28］，1%tBHQ(W/W)喂养 4 周后，可减轻缺血/再灌注引起的小鼠大脑皮质损伤，增强皮质的NQO 1蛋白表达水平，而此现象在Nrf2－/－小鼠中未出现。

虽然最初对于Nrf2的研究表明，此蛋白非生物体生长发育的必需物质，但是越来越多的研究成果表明Nrf2蛋白在抵抗外来刺激、保护机体功能中发挥着极其重要作用。Nrf2基因敲除的动物组织较正常组织更易受到各种毒性的损害。机体内氧化还原水平失衡是众多疾病的病理生理基础，对于机体内源性抗氧化损伤通路Nrf2-ARE的调控，无疑为抗氧化治疗提供了新思路。

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