韩晓博,曹悦鞍

变应性鼻炎(allergic rhinits,AR)发病率逐年升高,其治疗一直都是临床关注的重点。鼻用糖皮质激素因为有着强大的抗炎作用,是目前最有效的一线治疗药物,对于其抗炎作用机制还处于研究阶段。P物质(substance P,SP)是由感觉神经末梢释放的一种具有促炎作用的神经肽,与变应性鼻炎的发生和发展密切相关。近期有研究发现糖皮质激素有降低哮喘患者肺泡中SP含量、上调中性内肽酶活性等作用[1]。但鼻用糖皮质激素对于变应性鼻炎鼻黏膜中SP的表达是否有调节作用鲜见报道。本研究旨在通过建立卵白蛋白致敏变应性鼻炎大鼠模型,对于模型组采用布地奈德进行滴鼻治疗,观察鼻腔局部应用糖皮质激素布地奈德的治疗效果,探讨其对变应性鼻炎鼻黏膜中SP的影响及机制。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 实验动物 清洁级健康Wistar大鼠30只,雌雄各半,体质量180～220 g,购自中国农业大学实验动物中心。动物饲养环境温度为20～25℃,湿度45%～55%。实验过程中,动物以标准颗粒饲料、自来水喂养。

1.1.2 药品与试剂 卵白蛋白(Sigma公司),氢氧化铝干粉(天津化学试剂厂),布地奈德(阿斯利康制药有限公司),水合氯醛(沈阳化学试剂公司),多聚甲醛(天津化学试剂厂),大鼠SP浓缩型多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司),即用型SP免疫组织化学试剂盒(中杉生物工程有限公司),浓缩型二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)显色试剂盒(北京中山金桥生物技术有限公司)。

1.1.3 实验仪器 BX41数字显微成像仪及显微图像分析系统:日本Olympus公司产品;LEICARM-2135切片机:德国Leica公司产品;ZMN-7803自动组织包埋机:常州市华利电子公司产品;ZMN-9802电脑全自动脱水机:常州市华利电子公司产品;ZMN-6802烘漂处理仪:常州市华利电子公司;HH-4四孔恒温水浴锅:江苏省金坛市恒丰仪器厂产品。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将Wistar大鼠30只,随机分为正常对照组(对照组)、变应性鼻炎模型组(模型组)、布地奈德治疗组(治疗组),每组10只,分笼饲养。

1.2.2 动物模型制备 参照经典动物造模方法[2]。模型组及治疗组,①基础致敏:以卵白蛋白(ovalbumin,OVA)0.3 mg+Al(OH)3 30 mg+生理盐水1 ml制成混悬液,腹腔内注射,隔日1次,共 7次;②局部激发:基础致敏完成后,以2%OVA双侧滴鼻,每侧50μl,每日1次,共7次。对照组以等量生理盐水代替OVA,方法和步骤不变。治疗组于局部致敏第8天开始布地奈德滴鼻治疗,剂量为20μg/kg,连续给药3周。其余两组均将布地奈德换用生理盐水滴鼻。

1.2.3 鼻部症状评分标准 观察动物搔鼻动作、喷嚏、鼻溢和觅食行为改变。每次鼻部激发后均观察动物搔鼻动作、喷嚏、鼻溢和觅食行为。末次激发后即刻及0.5、1、2 h观察动物上述表现。鼻痒:轻度为1分,轻擦鼻几次;重度为 2分,抓挠鼻、面不止,到处擦磨。喷嚏:1～3个为1分,4～10个为2分,11个以上为3分。清涕:流到鼻前孔为1分,过鼻前孔为2分,流涕满面为3分。以叠加法记录总分,总分超过5分即为建模成功[3]。

1.2.4 病理组织学标本制备 治疗结束后全麻处死,剥除上颌骨部皮肤,沿鼻中线剪开鼻背,暴露鼻中隔和双侧鼻腔。取下双侧鼻甲及鼻中隔,放入4%多聚甲醛中固定,移入10%乙二胺四乙酸(EDTA)中脱钙后,制成蜡块,进行苏木素-伊红(HE)染色。应用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连结法进行免疫组化染色。

1.2.5 鼻黏膜中SP的测定 结果判断:光镜下鼻黏膜细胞出现棕黄色产物为阳性反应,强阳性表现为深棕色,弱阳性表现为浅黄色。采用计算机图像分析系统检测阳性细胞的平均光密度值,代表该切片SP的表达水平。平均光密度值越大,染色越深,SP表达越强。

1.3 统计学处理 采用SPSS 15.0软件进行统计分析,实验数据以均数±标准差(±s)表示。3组间比较采用单因素方差分析,组间比较采用多重比较(LSD)法检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鼻部症状评分 经OVA致敏的模型组和治疗组20只大鼠叠加评分均大于5分,激发后30 min内即出现打喷嚏、鼻腔分泌物增多,烦躁不安,互相摩擦撕咬的症状,局部激发2 h后症状逐渐减轻。动物造模需7 d,7 d后鼻部症状评分超过5分入选模型组及治疗组。对照组大鼠仅有轻微擦鼻表现。经布地奈德滴鼻治疗后,治疗组大鼠的症状逐渐减轻。3周后,基本接近正常对照组的水平。

2.2 组织病理学改变 对照组大鼠鼻黏膜无明显嗜酸性粒细胞及炎细胞浸润。模型组可见鼻黏膜下组织间质水肿,小血管扩张,大量淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞等多种炎性细胞浸润,部分有纤毛紊乱,坏死甚至柱状上皮鳞化。治疗组鼻黏膜无明显水肿,黏膜下可见散在炎细胞浸润。见图1～3。

2.3 鼻黏膜中SP的免疫组化 SP阳性表达在胞浆及胞核。正常对照组大鼠鼻黏膜鼻上皮细胞之间、上皮下、固有层及小血管和腺体周围的表达成弱阳性。模型组大鼠鼻黏膜上述各细胞SP的表达与对照组相比显著增强。给予布地奈德治疗后,治疗组大鼠鼻黏膜中SP表达明显减弱。见图4～6。半定量大鼠鼻黏膜中SP的平均光密度值比较显示,模型组明显高于对照组和治疗组,差异有统计学意义(P均＜0.05);治疗组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 各组大鼠鼻黏膜中SP的表达(光密度值,s)

表1 各组大鼠鼻黏膜中SP的表达(光密度值,s)

注:模型组与对照组和治疗组比较,▲P＜0.05

组别 n SP对照组 10 0.229±0.031模型组 10 0.313±0.028▲治疗组 10 0.246±0.025

3 讨论

变应性鼻炎是由IgE介导的,并由多种免疫活性细胞和细胞因子参与的鼻黏膜慢性炎症反应性疾病[4]。其发病机制复杂,至今仍未完全明确。SP是初级感觉神经无髓鞘C型纤维末梢分泌的一种神经肽,是具有促炎作用的主要感觉神经肽之一,通过与其靶细胞或其他结构上相应的高亲和力受体结合而发挥生物学作用,具有强烈的扩张血管、收缩气道平滑肌、增加腺体分泌、增加微血管渗透性效应[5]。变应性鼻炎鼻黏膜上皮损伤时,鼻黏膜炎症介质刺激暴露的C类纤维末梢,通过轴突发射从感觉神经的侧突分支释放SP,并在鼻黏膜发挥生物活性。同时,SP还可以刺激肥大细胞脱颗粒释放组胺、白三烯等炎性介质[6],组胺等炎性介质反过来也可促进SP的释放,从而通过这一正反馈机制加重炎症反应的扩散,导致血管扩张和血管通透性增加、炎性物质渗出、血浆外渗及黏膜水肿等。SP对多种炎性介质具有广泛的影响,在启动和加重变应性炎症过程中起了重要的作用[7]。因此,减少SP的释放可以减轻鼻黏膜炎症反应,甚至逆转病理学的变化。已知酶促降解是神经肽的主要失活方式,但调节SP的确切机制尚不清楚。

糖皮质激素是目前已知的最有效的抗炎药物,其抗炎机制十分复杂,主要是通过对参与炎症过程的多种细胞和分子功能的干预而实现。鼻用糖皮质激素具有副作用小、抗炎作用明显的特点,可以有效减轻鼻溢、喷嚏、鼻痒等临床症状[8],其疗效已得到临床的广泛认可。

本实验通过建立变应性鼻炎大鼠模型,观察3组大鼠鼻黏膜的病理形态学改变,治疗组与模型组比较鼻黏膜炎症反应明显减轻,验证了布地奈德对于变应性鼻炎的治疗作用。经布地奈德治疗后,大鼠变应性鼻炎鼻黏膜中SP的表达较模型组也明显降低。分析其原因可能是布地奈德参与上调中性内肽酶活性,从而促进酶促降解的发生,使SP的释放减少[9]。另外,作为布地奈德高效局部抗炎作用的糖皮质激素可以有效减少鼻黏膜中的抗原呈递细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞等的活化程度,从而下调炎症反应水平,减少炎性介质释放,这一作用也可以阻断SP与炎性介质之间的正反馈机制,减少SP的释放。

综上所述,布地奈德可以显著降低变应性鼻炎鼻黏膜中SP的水平,从而减轻鼻黏膜的变应性炎症反应。

[1]张晗,尚云晓,叶丽红,等.吸入糖皮质激素对哮喘患儿血浆及支气管诱导痰液中P物质含量的影响及其机制研究[J].临床儿科杂志,2006,24(1):13-15,33.

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