田 力,曹悦鞍

迄今为止,大肠癌的发生和发展的确切机制尚未阐明,但一般认为是一个涉及多因素、多步骤、多基因改变的复杂过程,包括癌基因的激活、抑癌基因的失活,以及微卫星不稳定等。以往的研究认为肿瘤的分期是影响肿瘤发展和预后的唯一因素。自1993年发现错配修复基因缺陷与大肠癌的发病相关以来[1-2],越来越多的实验研究证实错配修复基因的失活在大肠癌的发生及预后中起着重要的作用。本文归纳了近年来对错配修复基因的相关研究,阐述其在大肠癌发生、发展过程中的作用机制,并探讨其临床预后、预测的意义。

1 错配修复基因系统的分子基

微卫星是分布生物基因种系中串联的重复系列,包含单核苷酸、双核苷酸或多核苷酸重复序列,如(A)n或(CA)n。这些重复序列突变易积累,主要是因为DNA聚合酶在DNA合成过程中不能将DNA双链有效正确配对起来。微卫星不稳定(microsatellite instability,MSI)最常见的错误是碱基错误配对,逃脱了DNA聚合酶、插入-缺失回路的本身固有的校对功能。肿瘤的MSI是指与正常细胞相比,肿瘤细胞中某一微卫星长度发生改变,也称“复制错误”表型或“普遍性体细胞突变”。所谓“普遍性体细胞突变”是指在人体细胞基因组中普遍存在的被称为微卫星的简单重复序列拷贝数的改变。MSI分为3类,①高频MSI(MSI-H):2个或多个微卫星位点不稳定(或检测的大板标记中大于30%的位点不稳定);②低频MSI:只有1个微卫星位点不稳定(10%～30%标记位点不稳定);③微卫星稳定(microsatellite stability,MSS):也称为无不稳定微卫星位点(小于10%标记点不稳定)。MSI的发生与错配修复基因系统缺失密切相关。MSI-H通常称为DMMR,MSI、MSS称为PMMR。

错配修复基因系统(mismatch repaire,MMR)是机体内DNA修复机制的一种形式,广泛存在于生物体内,在防止基因突变、维持基因组稳定性和DNA复制高保真的过程中起关键作用,具有对微卫星监测及对其错误的更正修复功能。人类错配修复系统是人体细胞中存在的一种能修复DNA碱基错配的安全保障系统,它由一系列能特异性识别、双向切除并修复错配碱基的酶分子组成,对保持遗传物质的稳定性和完整性、避免遗传突变的产生具有重要作用。MMR系统主要包含以下几种蛋白:MLH 1、MSH2 、MSH 3、MSH6 和 PMS2,它们之间相互连接形成异源二聚体。MSH 2分别与MSH6、MSH 3配对形成 MutSα复合物和 MutSβ。MutSα可识别单个碱基错配,MutSβ可识别2～4个碱基甚至更多的插入或缺失错配[3]。MLH 1则分别与 PMS2、PMS1和 MLH3 形成 MutLα、MutLβ 和MutLγ复合物。这些蛋白复合物一旦检测到碱基错配,就能与有关的酶配合,切除含有错配的DNA片段,并合成新的DNA片段以代替被切除的部分,进而完成错配DNA链的修复过程。MMR缺失会导致DNA链错配的积聚,从而导致MSI。

2 MSI与大肠癌

2.1 MSI引起结直肠癌的分子机制 MSI引发的特殊基因和信号转导途径突变,是导致大肠癌的机制之一。错配修复基因缺失(deficient mismatch repair,dMMR)引起微卫星不稳定,微卫星重复序列中30多个基因突变,如DNA修复蛋白MRE11A、hRAD50、转化生长 因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)受体 Ⅱ、胰岛素样生长因子(insulin-like grow th factor,IGF)受体Ⅱ、前凋亡因子Bax、错配修复蛋白MSH3和 MSH6等[4]。这些基因在细胞功能及转导途径中发挥多种作用,其突变的急速积聚可诱发大肠癌的发生。

BRAF基因突变已被证实在大肠癌发病机制中发挥重要作用,BRAF15外显子基因编码丝氨酸-苏氨酸激酶,在促分裂原活化蛋白激酶信号通路(RAS/RAF/MEK/MAP)起重要作用,而 RAS/RAF/MEK/MAP激酶途径在胞内信号转导途径中有重要作用,调节细胞的增殖、分化和凋亡。BRAF突变可导致促调亡蛋白(Bcl-2 interacting mediator of cell death,Bim)的抑制而抑制细胞凋亡,促进结直肠肿瘤的发展[5]。BRAF磷酸化在人类肿瘤中能激活促分裂原活化蛋白(mitogen-activated protein,MAP)/细胞外信号调节激酶(extracellular signalregulating kinase,ERK)1/2,并磷酸化 ERK1/2,激活MAPK(促分裂原活化蛋白激酶),即激活了RAF-促分裂原活化蛋白激酶信号通路(RAF-MEKERK1/2);ERK1/2被激活后,使Bim磷酸化,阻止其绑定到Bcl-2目标上,从而抑制细胞凋亡[6]。

BRAF突变在散发的hMLH1甲基化的结直肠癌中普遍存在,已有研究表明BRAF突变与DNA错配修复缺乏导致的hMLH 1甲基化相关。例如有实验证实87%的有hMLH1甲基化的结直肠癌细胞系中存在BRAF突变,而仅4%的hMLH1未甲基化的细胞系中存在 BRAF突变[7-8]。Domingo等[9]研究显示,BRAF V600E突变在散发性MSI-H肿瘤中占40%(82/206),但是在111例遗传性非息肉性结直肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC)中未检测出该突变。另一实验研究显示,任何 HNPCC患者中均未检测到 BRAF V600E突变[10]。结果显示,BRAF突变经常出现在hMLH 1甲基化散发性结直肠癌(colorectal cancer,CRC)患者中,但是不会出现在HNPCC相关的肿瘤患者中。这种BRAF突变的差异可能会用于鉴别散发的 MSI-H CRC患者和 HNPCC患者。Nagasaka等[7]检测了11个位点的启动子的甲基化状态与BRAF突变的相关性,发现BRAF突变与平均7.2个(95%,CI:6.6～7.9)位点甲基化相关。而在散发性大肠癌中,hMLH1甲基化是导致MSI的主要因素。很多实验证实,BRAF突变与MSI高度相关[8,11-12]。有报道BRAF突变仅在MSI-H肿瘤中存在,而KRAS突变在MSI-L或MSS肿瘤中可被检测出[13]。故可以推测,散发性CRC的MSI肿瘤发展可能经由BRAF途径,但相关机制至今没有被详细阐述。

磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)是肿瘤形成的启动子之一,PIK3CA在PI3K通路中发挥关键作用,在 30%CRC患者中发生PIK3C突变[14]。MSI肿瘤PIK3CA突变多于MSS肿瘤[14-15]。MSI肿瘤可能也经由PI3K/ATK/mTOR(磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)信号通路。

BRAF突变,KRAS突变、CpG岛甲基化、PIK3C突变、微卫星不稳定性都在结直肠肿瘤中被高频检测到。近年来研究热点包括四者之间是否存在相关性,以及它们之间的相互作用、导致结直肠癌发生、发展的机制。

2.2 遗传性非息肉性结直肠癌与散发性结直肠癌MSI的发生机制 遗传性非息肉性结直肠癌与散发性结直肠癌dMMR发生机制不同。MLH 1、MSH 2、MSH 6和 PMS2等基因系突变易导致HNPCC的发生[16]。基因表型是 HNPCC的诊断金标准。79%～93%HNPCC为 MSI表型。MSI作为HNPCC的基因标志物作用已在临床中得到认可。由MMR基因变异引起的HNPCC MSI阳性病例随年龄增长逐渐下降,大于 50岁患者只有17%。MMR基因突变引起男性大肠癌发生率为60%～70%,女性则为30%～40%[17-18]。HNPCC是常染色体显性遗传疾病,占结直肠癌总发病率的2%～3%[19]。其特征是发病年龄轻,多小于50岁,有家族史,以右半结肠癌为主,常伴有同时和异时结肠原发癌及结肠外肿瘤,组织病理学符合 Lynch syndrome(印戒细胞、生长缓慢、类克隆病反应、黏蛋白含量＞50%、肿瘤淋巴细胞浸润)。该类患者预后较好,5年生存期大于散发结直肠癌患者。

在MSI-H散发性结直肠癌中,通常发病年龄超过70岁,主要是MLH 1的CpG岛高甲基化表型致d MMR引起,肿瘤抑制基因转录沉默[8]。MLH 1沉默占MSI-H病例的 95%,MSH 2、MSH6分别占MSI-H的 5%和不足1%[20]。与 MSI-L、MSS相比,MSI-H病例有显著特点,即发病年龄相对年轻、分化高、发病部位为近段结肠、分期早、不易转移,且预后较好[21]。

3 MSI在结直肠癌预后及治疗中的作用

一些临床研究表明,CRC中MSI发生率波动于8%～20%,这与肿瘤分期相关。Ⅱ期患者MSI发生率最高为20%,Ⅲ期为12%,Ⅳ期发生率最低为4%[19,22]。其原因还未明确。

MSI表型主要有3个临床用途,即:CRC预后;预测对化疗药物的反应,如氟尿嘧啶(5-FU)、伊立替康等;对HNPCC的基因评估。MSI CRC预后相对MSS更好,不易发生淋巴结转移和远处转移。这个结论被随后的临床研究所证实[23]。对32个临床研究数据进行meta分析,共包含了7 642例CRC病例,其中1 277病例表型为MSI,分析结果显示出MSI肿瘤患者预后良好优势[22]。提示MSI在CRC中预后价值的优越性。2009年美国临床肿瘤学会(ASCO)年度会议上提出MSI在Ⅱ期CRC预后价值较Ⅲ期更显著[24]。

MSI作为5-FU、伊立替康等化疗药物敏感性的预测分子标志物,目前还有争论[25-26]。Sargent等[27]回顾性研究包含5个临床中心的随机对照研究5-FU为基础的辅助化疗方案对Ⅱ期、Ⅲ期CRC患者的疗效,使用奥沙利铂、伊立替康、口服氟尿嘧啶等药物患者被排除在研究范围外。结果证实,dMMR在Ⅱ期CRC发生频率更高,行5-FU为基础的化疗方案对PMM R和Ⅲ期dMMR CRC患者有效,可提高其无病生存期(isease-free surial,DFs)。但对于dMMRⅡ期CRC患者,化疗不仅没有疗效优势,甚至于对MSI CRC患者有危害,可显著减低其DFA和总生存期。

伊立替康是拓扑异构酶Ⅰ抑制剂。拓扑异构酶Ⅰ可引起DNA链在复制和转录过程中出现暂时缺口。伊立替康可结合到DNA-拓扑异构酶Ⅰ复合物上,阻碍DNA再连接,导致DNA双链分解。如果DNA修复系统不能发挥作用,最终导致细胞的凋亡。微卫星MRE11A、hRAD50突变会引起DNA修复功能障碍,理论上可能对伊立替康有效。有4个临床研究分析伊立替康对 MSI CRC的治疗作用。其中,第1个研究示单中心72例CRC转移患者按微卫星状态分类,接受伊立替康治疗的临床试验[28]。第2个研究是美国肿瘤与血液病学研究组(GALGB)治疗方案前瞻性研究702例Ⅲ期CRC患者,比较5-FU联合伊立替康与单药5-FU辅助化疗疗效比较[29],数据显示MSI-H联合方案治疗组有5年无病生存期优势,但无显著性优势。MSS肿瘤患者未显示出联合化疗的优势。在2009 ASCO年会上提供的研究数据未证实前者结论。在这个研究中,回顾性分析了一项随机试验PETACC-3试验中1 254例Ⅱ期和Ⅲ期CRC患者,其中188例MSI-H患者伊立替康治疗后生存期无改善。Meta分析也未得到Ⅳ期MSI CRC患者接收伊立替康为基础的化疗方案的有效性[28,30]。因此,还需更多的临床研究来证实伊立替康对MSI肿瘤的治疗作用。

基于上述的研究,2011年结直肠癌的美国国立综合癌症网络(NCCN)指南提出,对小于50岁的CRC患者,应该考虑行MMR基因检测。Ⅱ期MSI-H CRC患者预后好,但5-FU辅助化疗不能使其受益。

许多研究结果证实,MSI是大肠癌的发病机制之一。MSI肿瘤信号通路的研究对其治疗策略提供了新思路。例如。微卫星MRE11A、hRAD50突变会引发DNA双链分解修复系统缺失,体外细胞实验证实PARP-1抑制剂可抑制MSI细胞系的生长和MRE11A的表达水平,有可能成为治疗MSI肿瘤的有效靶向剂。由于连接图谱生物技术的应用,LY-294002和西罗莫司(PI3K/ATK/mTOR信号通路靶向剂)会引起基因表达改变,从而抑制MSI肿瘤的表达[31]。这个发现也进一步明确了MSI肿瘤的PI3K/ATK/mTOR信号通路,并帮助研发新的靶向治疗剂。

随着分子生物实验技术的提高,MMR的基因检测相对简单、方便,准确率高。MMR在大肠癌发生、发展中起重要作用,是大肠癌预后及疗效预测的分子标志之一。但仍需更多的大宗临床试验及数据来完善MSI在CRC中的作用。尤其在中国,尚未有临床试验进行此研究。不同的MMR基因在不同类型的CRC中发挥的作用不同,具体作用机制仍需进一步研究予以阐明,是否存在其他的错配修复基因及其潜在作用需要进一步探索。dMMR的遗传标记的明确和快速准确的检测方法也需要进一步研究。这些研究的进一步深入会对大肠癌的预防、早期诊断及治疗提供更大的帮助。

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