李晶，赵海燕 ，李鲲鹏

1.昆明总医院 设备科，云南 昆明650032；2.云南省第一人民医院 眼科，云南 昆明 650032；3.中山大学生物防治国家重点实验室，广东 广州510275

生物大分子电子断层三维重建与分子模拟技术

李晶1，赵海燕2，李鲲鹏3

1.昆明总医院 设备科，云南 昆明650032；2.云南省第一人民医院 眼科，云南 昆明 650032；3.中山大学生物防治国家重点实验室，广东 广州510275

本文提出了生物大分子电子断层三维重建与分子模拟技术，阐述了该技术的立论依据和需要研究的内容。对该技术的深入研究有利于预测蛋白质的空间结构，为蛋白质三维形态分析提供新的技术方法。

蛋白复合物；三维重建；三维分割；分子模拟

蛋白质分子是由20种不同的氨基酸通过共价键连接而成的线性多肽链，每一种蛋白质在天然条件下都有自己特定的空间结构。但以一定氨基酸顺序排列的多肽链是如何形成有一定空间结构的蛋白质分子的？这个空间结构中有着什么样的规律？其有什么样的变化和行为？这些均是近年来人们力图解决的重要问题。

1 生物大分子结构的测定方法

测定生物大分子结构的主要方法有3种：X射线单晶衍射方法、核磁共振（NMR）方法和电子显微学方法。X射线单晶衍射方法主要用于可结晶的生物大分子单体；NMR的方法通常使用于30kDa以下的生物分子；电子显微学方法虽然无法直接得到生物大分子的三级结构，但是它可以在较广的尺度范围内获得从生物大分子单体到复合物、组装体的三维结构。

电子显微学主要包括3种技术：① 电子晶体学，这是最早发展起来的生物大分子三维重建技术，也是电镜三维重建技术中分辨率最高的。这种技术要求对样品进行二维结晶，由于大多数样品结晶是很困难的，所以限制了技术的应用。② 单颗粒技术，其重建分辨率接近7.5A[1]，但这种技术要求样品是全同性的，也限制了此技术的应用和分辨率的进一步提高；③ 冷冻电镜电子断层扫描技术（Cryo-Electron Tomography，CET），该技术分辨率不高,现在最高只有4～5nm[2]；但是该技术对样品的要求最低，应用范围最广，只要大小合适（10～200nm）即可[3]。对于部分非全同性的超分子复合体和细胞超微结构等一定尺度的生物结构，这种技术是唯一的选择。其次这种技术与低温电子显微术相结合，能够对样品进行原位、非侵入性的研究。通过低温技术能够对生物样品进行高时间分辨的生化生理反应定格，即可对在一定功能条件下的生物大分子的三维空间结构进行研究。这种合成技术对蛋白质结构与功能关系研究极为有效。对于它分辨率不足的缺点，可以通过分子模拟方法进行解决。这就是本研究的基本思路：一方面是利用低温技术、电子断层扫描技术方法的优点，发展出中等分辨率蛋白的三维重构方法；另一方面，以三维重构结果为基础，加上分子生物学对序列的测定，建立预测生物大分子二、三级结构的计算机模型，再结合现代分子生物学的定位技术，对蛋白质的功能结构域进行局部的三级结构计算机分割、控制与计算。

分子模拟主要是指蛋白质的结构模拟，是利用计算机建立原子水平的分子模型来模拟分子的结构与行为，进而模拟分子体系的各种物理与化学性质。利用分子模拟技术结合计算机图形技术可以更形象、更直观地研究蛋白质等生物大分子的结构。蛋白质空间结构的清晰表述和研究，对揭示蛋白质结构和功能的关系，总结蛋白质结构的规律，预测蛋白质肽链折叠和蛋白质结构等，都是有力的促进。

2 国内外电子显微学研究进展

国外在大分子蛋白电子显微学研究方面，已经开始研究具有非全同性的生物样品的三维重建方法，更多地采用冷冻电镜电子断层扫描技术。美国显微镜和图像研究国家中心应用电子断层扫描技术获取大尺度生物样品的结构信息。欧洲分子生物学实验室已开始用电子断层扫描技术研究V-ATP酶以及与F-ATP酶相似的生物大分子的三维结构[4-5]。Baylor医学院研究相对分子量在300kDa～30MDa的生物大分子聚合体。现在正应用电子断层扫描技术以直接观察到生物大分子的多肽骨架[6-7]。Texas大学实验室主要开发包括冷冻电镜技术和计算机三维重构方法[8-9]。在分子模拟方面，预测蛋白质空间结构的方法可以分为2大类：① 分子动力学方法；② 基于知识的预测方法。第一类方法在数学上遇到了难以解决的多重极小值问题，而第二类方法又受到预测精度的限制。近年来，国际上一些研究组发展了一些从蛋白质的一级结构直接预测蛋白质空间结构的新方法：遗传算法[10]、模拟退火[11]、多维统计[12]、模糊集合论方法[13]等，这些方法在对一些简单蛋白质分子的模拟研究中已经显示出强有力的作用，对复杂蛋白质分子的模拟研究还有很多问题需要研究。

国内电子显微学三维重建研究相对于国外起步较晚，有中科院电镜室、中科院生物物理所、武汉大学生科院、清华大学等在进行电子显微学方面研究工作[15-16]。研究的对象基本上是具有全同性和对称性的生物样品，如二十面体对称的病毒颗粒，采用的是单颗粒技术。在图像处理方面都是借助国外现成的软件。在分子模拟方面国内主要借助国外提供的软件有Insight II和Quanta来进行模拟应用。

3 研究项目介绍

本项目选择MCM（Minichromosome Maintenance）蛋白复合物、浓核病毒、登革病毒作为研究材料，原因是人类MCM蛋白复合物并不出现在正常的非增殖细胞中，仅仅在癌变细胞中获得表达，可以作为特征标记检测癌变细胞或作为抗癌药物的作用靶点[14]。浓核病毒、登革病毒也是动植物中非常重要的致病因子。在形态上MCM可以作为非全同性颗粒的代表。国内部分实验室，初步建立起蛋白质电子晶体学技术和设备，初步建立起连续切片三维重构技术，已经得到一些病毒包括浓核病毒、登革病毒的三维结构[17-20]，并初步完成MCM的表达与纯化工作，为此项技术的开发奠定了基础。

本项目综合国内外的研究状况，考虑各种技术的优劣，提出应用冷冻电镜电子断层扫描方法对大分子蛋白复合物进行三维重建，并基于重建三维结构数据，进行计算机分子模拟。这个方面的研究在世界范围内也是近几年才起步，以人的MCM作为研究对象的电子断层扫描的三维重建研究，基于CET方法电镜数据分子模拟技术研究，尚未见报道；另外还有很多在结构上与MCM相类似的生物大分子的三维结构急待解析而又未能解析。建立冷冻电镜电子断层扫描三维重建技术，能实现对大分子蛋白复合物二、三级结构的预测，在分子水平上对蛋白质任意局部分割，量化计算，控制改变任意局部的空间位置。同时，这也能为疾病诊断与药物的研制开发奠定基础。

[1] Yi zhi,Tao wei zhang,Recent developments in cryo-electron microscopy reconstruction of single particles[J].Current Opinion in Structural Biology,2000,(10):616-622.

[2] S Van Aert,A J,den Dekker,et al.High-resolution electron microscopy and electron tomography: resolution versus precision[J].Journal of Structural Biology,2002,(138):21-33.

[3] P A Thuman-Commike,W Chiu.Reconstruction principles of icosahedral virus structure determination using electron cryomic roscopy[J],Micron,2000,(31):687-711.

[4] Krebstakies T,Zimmermann B,Graber P,et al.Both rotor and stator subunits are necessary for efficient binding of F1 to F0 in functionally assembled Escherichia coli ATP synthase[J].J Biol Chem,2005,80(39):38-45.

[5] Zimmermann B,Diez M,Zarrabi N,et al.Movements of the epsilon-subunit during catalysis and activation in single membrane-bound H(+)-ATP synthase[J].EMBO J,2005,24(12):2053-2063.

[6] Jiang W,Chang J,Jakana J,et al.Structure of epsilon15 bacteriophage reveals genome organization and DNA packaging/injection apparatus[J].Nature,2006,439(7076):612-616.

[7] Paredes A, Weaver S, Watowich S,et al.Structural biology of old world and new world alphaviruses[J].Arch Virol Suppl,2005,(19):179-185.

[8] Cong Y,Jiang W,Birmanns S,et al.Fast rotational matching of single-particle images[J].Struct Biol,2005,152(2):104-112.

[9] Yu X, Shah S, Atanasov I,et al.Three-dimensional localization of the smallest capsid protein in the human cytomegalovirus capsid[J].Virol,2005,79(2):1327-1332.

[10] Yang H,Ahn JH,Ibrahim RK,et al.The three-dimensional structure of Arabidopsis thaliana O-methyltransferase predicted by homology-based modelling[J].Mol Graph Model,2004,23(1):77-87.

[11] Benaki DC,Mikros E,Hamodrakas SJ.Conformational analysis of peptide analogues of silkmoth chorion protein segments using CD,NMR and molecular modelling[J].Pept Sci,2004,10(6):381-392.

[12] Butterfield A,Vedagiri V,Lang E,et al.PyEvolve: a toolkit for statistical modelling of molecular evolution[J].BMC Bioinformatics,2004,5(1):1.

[13] T E Exner,M Keil,J Brickmann.Fuzzy Set Theory and Fuzzy Logic and Its Appliction to Molecular Recognition [J].Engel,T.(Eds.),Wiley-VCH,Weinheim,2003:1216-1238.

[14] The structure and function of MCM from archaeal[J].Thermoautotrophicum.Nat Struct Biol,2003,10(3):160-167.

[15] 王大能,陈勇,隋森芳.电子显微学在结构生物学研究中的新进展[J].电子显微学报,2003,22(5):449-455.

[16] 郑东,T Xue,谌东华,等.利用低温电镜术和像重构方法研究兔出血症病毒的三维结构[J].科学通报,2001,46(1):39-43.

[17] Z Hong Zhou,Hong Zhang,Joanita Jakana,et al.Cytoplasmic polyhedrosis Virus Structure at 8A by Electron Crymicroscopy:Structural Basis of Capsid Stability and mRNA Processing Regulation[J].Structure,2003,(11):651-663.

[18] Hong,Zhang,Xue-Kui-Yu,Xing-Ying Lu,et al.Molecular Interaction and Viral Stabiligy Revealed by Structural Analyses of Chemically treated Cypovirus Capsids[J].Virology,2002,298:45-52.

[19] Zhang H,Zhang J,Yu X,et al.Visualization of protein-RNA interactions in cytoplasmic polyhedrosis virus[J].JOURNAL OF VIROLOGY,1999,73(2):1624-1629.

[20] Cheng Lingpeng,Zhou Zhenghong,Chen Senxiong,et al.The three dimensional structure determination of C6/36 DNV[J].SCIENCE IN CHINA(Series C),2004,34(1):75-79.

Three Dimensional Reconstruction from Cryoelectron Tomography of Biomacromolecules and Molecular Simulation Techniques

LI Jing1，ZHAO Hai-yan2，LI Kun-peng3
1.Equipment Department,Kunming General Hospital,Yunnan Kunming 650032,China; 2.Ophthalmology Department,Yunnan Province First People'sHospital,Y u n n a n Kunming 650032,China; 3.State Key Laboratory for Biocontrol,Sun Yatsen University,Guangzhou Guangdong 510275,China

The paper have put forward biomacromolecules protein complex three dimensional reconstruction from Cryoelectron tomography (CET) and molecular simulation by computer technique, its science base and arguments are studied in the paper. In-depth research in the field is help to forecast space structure of protein, and providing new way for three dimensional morphology analysis.

protein complex; three-dimensional reconstruction; three-dimensional segmentation;molecular simulation

TP301.6

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2011.08.018

1674-1633(2011)08-0058-02

2011-03-02

2011-04-18

国家自然科学基金（30770540）

赵海燕，主治医师。

作者邮箱：li_jingkm@126.com