王艳颖， 罗都强， 师宝忠， 杨小龙

(河北大学生命科学学院药物化学与分子诊断教育部省部共建重点实验室，河北保定071002)

番石榴Psidium guajava L为桃金娘科Myrtaceae番石榴属Psidium植物，为常绿灌木或小乔木，又名番秸、鸡屎果和番桃等。番石榴原产于南美洲热带地区，现广泛分布于热带及亚热带地区，在我国广东、广西、福建、海南、台湾等省区均有野生及人工栽培［1］。番石榴叶具有明显的降血糖、抗病毒及抗菌等活性，其中含有多种化学成分，迄今从中已分离并获得的有三萜类、黄酮类、鞣质类、倍半萜类等成分［2］。近年来，植物内生真菌的研究已成为一大热点，很多研究者已从植物的内生真菌中分离得到与宿主相同或相似的生理活性成分。Pestalotiopsis zonata为拟盘多毛属Pestalotiopsis真菌，本实验首次对寄生在番石榴叶中的P.zonata的次级代谢产物进行了化学成分的研究，以期对其药用活性成分开发提供基础资料，从中分离鉴定了12个已知化合物，所有化合物均尚未见从该内生真菌中分离得到的相关文献报道。

1 仪器与材料

Bruker AVANCE III-600核磁共振谱仪;EI，ESI和FAB-MS:APEIII FT-MS质谱仪;Waters600-2489高效液相色谱仪;柱色谱硅胶和制备薄层色谱硅胶GF254均为青岛海洋化工产品;反相硅胶(ODS-A);Sephadex LH-20。

该菌株由浙江大学农业与生物技术学院张敬泽教授提供(2004年5月采自海南兴隆，P.zonata分离自番石榴叶部)。

2 发酵培养

培养基:葡萄糖20 g，去皮土豆200 g，MgSO41.5 g，KH2PO43 g，VB110 mg，加水搅拌混合至1 000 mL。透明三角瓶(大小:500 mL，培养基体积:300 mL)共接种30 L。柠檬酸0.1 g/mL，调pH值6.0～6.5，温度:21～23℃，转速:150 r/min，于摇床上培养发酵2周。

3 提取分离

发酵液30 L浓缩至4 L左右，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液减压回收乙酸乙酯，获得粗提物17.48 g，上硅胶柱(石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱)，得到若干不同极性组分，对其进一步分离纯化，具体方法有正、反相硅胶柱色谱，Sephadex LH-20(氯仿-甲醇=1∶1与纯甲醇两类)，HPLC，重结晶和制备型薄层色谱(PTLC)等，进而从提取物中得到化合物Ⅰ(5.8 mg)、Ⅱ(6.6 mg)、Ⅲ (6.3 mg)、Ⅳ(9.2 mg)、Ⅴ(7.8 mg)、Ⅵ (7.1 mg)、Ⅶ (6.5 mg)、Ⅷ (8.2 mg)、Ⅸ (7.4 mg)、Ⅹ (11.5 mg)、Ⅺ(10.4 mg)、Ⅻ (9.1 mg)。

4 结构鉴定

化合物Ⅰ:白色粉末 (甲醇)。EI-MS m/z:456［M］+;1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δH:7个甲基峰分别为0.88(s)，0.94(d，J=5.9 Hz)，0.97(d，J=6.3 Hz)，1.00(s)，1.01(s)，1.22(s)，1.24(s)，2.49(1H，d，J=11.2 Hz，H-18)，3.31(1H，dd，J=5.4，11.3 Hz，H-3α)，5.43(1H，t，J=7.0 Hz，H-12);13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δC:39.6(t，C-1)，28.2(t，C-2)，78.3(d，C-3)，39.5(s，C-4)，55.9(d，C-5)，18.9(t，C-6)，33.8(t，C-7)，40.1(s，C-8)，48.1(d，C-9)，37.6(s，C-10)，23.7(t，C-11)，125.3(d，C-12)，139.2(s，C-13)，42.6(s，C-14)，28.8(t，C-15)，24.7(t，C-16)，48.7(s，C-17)，53.6(d，C-18)，39.7(d，C-19)，39.3(d，C-20)，31.1(t，C-21)，37.2(t，C-22)，28.9(q，C-23)，15.8(q，C-24)，16.6(q，C-25)，17.5(q，C-26)，24.0(q，C-27)，179.5(s，C-28)，17.6(q，C-29)，21.4(q，C-30)。由以上数据分析，并结合文献报道［3］，确定该化合物为乌苏酸(ursolic acid)。

化合物Ⅱ:白色粉末(甲醇)。EI-MS m/z:456［M］+;1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δH:5.26(1H，t，J=6.8 Hz，H-12)，3.99(1H，m，H-3)，3.33(1H，dd，J=4.0，10.8 Hz，H-18)，0.85，0.89，1.01，1.03，1.21，1.24，1.94(3H ×7，s，Me);13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δC:39.8(t，C-1)，27.9(t，C-2)，79.8(d，C-3)，40.6(s，C-4)，56.8(d，C-5)，19.6(t，C-6)，33.9(t，C-7)，39.9(s，C-8)，48.6(d，C-9)，38.2(s，C-10)，24.0(t，C-11)，123.7(d，C-12)，144.9(s，C-13)，42.9(s，C-14)，28.9(t，C-15)，24.1(t，C-16)，47.7(s，C-17)，42.8(d，C-18)，47.3(t，C-19)，31.7(s，C-20)，34.9(t，C-21)，33.6(t，C-22)，28.9(q，C-23)，16.4(q，C-24)，15.9(q，C-25)，17.8(q，C-26)，26.4(q，C-27)，180.2(s，C-28)，33.9(q，C-29)，24.6(q，C-30)。由以上数据分析，并结合文献报道［4］，确定该化合物为齐墩果酸(oeanlic acid)。

化合物Ⅲ:白色针状结晶(甲醇)。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δH:5.28(1H，t，J=6.8 Hz，H-12)，4.49(1H，t，J=8.0 Hz，H-3)，2.05(3H，s，OAc)，0.76，0.86，0.88，0.91，0.94，0.95，1.14(3H ×7，s，Me);13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δC:38.1(t，C-1)，22.9(t，C-2)，80.9(d，C-3)，37.7(s，C-4)，55.3(d，C-5)，18.2(t，C-6)，33.8(t，C-7)，39.3(s，C-8)，47.6(d，C-9)，37.0(s，C-10)，23.4(t，C-11)，122.5(d，C-12)，143.6(s，C-13)，41.6(s，C-14)，32.6(t，C-15)，23.5(t，C-16)，46.5(s，C-17)，40.9(d，C-18)，45.8(t，C-19)，30.6(s，C-20)，32.4(t，C-21)，27.6(t，C-22)，28.0(q，C-23)，16.6(q，C-24)，15.3(q，C-25)，17.2(q，C-26)，25.9(q，C-27)，184.3(s，C-28)，33.0(q，C-29)，23.5(q，C-30)，170.9(s，C-31)，21.2(q，C-32)。由以上数据分析，结合文献报道［5］，确定该化合物 3-乙酰氧基齐墩果酸(3αacetoxyoleanic acid)。

化合物Ⅳ:白色粉末(氯仿)。EI-MS m/z:262［M］+;1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δH:5.18(2H，s，H-3)，6.62(1H，s，H-4)，4.60(1H，d，J=6.7 Hz，H-1'a)，4.57(1H，s，H-1'b)，5.49(1H，t，J=6.7 Hz，H-2')，4.03(3H，s，OMe-7)，2.15(3H，s，Me-6)，1.75(3H，s，Me-3'-1)，1.81(3H，s，Me-3'-2);13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δC:169.0(s，C-1)，68.7(t，C-3)，109.5(s，C-3a)，99.5(d，C-4)，157.8(s，C-5)，120.8(s，C-6)，163.6(s，C-7)，148.1(s，C-7a)，62.1(q，OMe-7)，8.7(q，Me-6)，65.8(t，C-1')，119.0(d，C-2')，138.6(s，C-3')，18.3(q，Me-3'-1)，25.8(q，Me-3'-2)。由以上数据分析，并结合文献报道［6］，确定该化合物为 7-甲氧基-6-甲基-5-(3-甲基丁-2-烯-1-基氧代)异苯并呋喃-1(3H)-酮。

化合物Ⅴ:无色针晶(甲醇)。EI-MS m/z:152［M］+;1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δH:7.11(2H，br d，J=8.5 Hz，H-2，6)，6.71(2H，br d，J=8.5 Hz，H-3，5)，3.43(2H，s，H-7);13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δC:124.9(s，C-1)，129.7(d，C-2，6)，114.3(d，C-3，5)，155.2(s，C-4)，40.3(t，C-7)，174.6(s，C-8)。由以上数据分析，并结合文献报道［7］，确定该化合物为对羟基苯乙酸。

化合物Ⅵ:无色晶体(甲醇)。1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δH:7.03(2H，d，J=8.4 Hz，H-4，8)，6.72(2H，d，J=8.4 Hz，H-5，7)，3.70(2H，t，J=7.2 Hz，H-1)，2.73(2H，t，J=7.2 Hz，H-2);13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δC:62.3(t，C-1)，38.1(t，C-2)，115.9(s，C-3)，129.6(d，C-4，8)，114.8(d，C-5，7)，155.3(s，C-6)。由以上数据分析，并结合文献报道［8］，确定该化合物为酪醇，即对羟基-β-苯乙醇。

化合物Ⅶ:无色油状(氯仿)。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δH:4.46(1H，dd，J=4.9，10.8 Hz，H-2)，3.13(1H，dd，J=4.3，13.9 Hz，H-3a)，2.97(1H，dd，J=6.8，13.9 Hz，H-3b)，7.21-7.30(1H，m，H-2'，3'，4'，5'，6')，3.77(3H，s，OMe);13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δC:174.6(s，C-1)，71.3(d，C-2)，40.6(t，C-3)，136.3(s，C-1')，128.6(d，C-2'，6')，129.5(d，C-3'，5')，126.9(d，C-4')，52.5(q，OMe)。由以上数据分析，并结合文献报道［9］，确定该化合物为2-羟基-3-苯基丙酸甲酯。

化合物Ⅷ:无色针晶(甲醇)。ESI-MS m/z:399［M-H］-;1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δH:0.68(3H，s，Me-18)，1.01(3H，s，Me-19)，0.92(3H，d，J=6.7 Hz，Me-21)，0.84(3H，d，J=5.3 Hz，Me-26)，0.80(3H，d，J=5.3 Hz，Me-27)，0.79(3H，d，J=7.2 Hz，Me-28)，3.49(1H，m，H-3)，5.35(1H，d，J=2.4 Hz，H-6)。由以上数据分析，并结合文献报道［10］，确定该化合物为菜油甾醇。

化合物Ⅸ:无色结晶(甲醇)。FAB-MS m/z:117［M-H］-;1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δH:2.56(4H，m，2CH2);13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δC:175.8(s)，31.0(t)。由以上数据分析，并结合文献报道［11］，确定该化合物为琥珀酸。

化合物Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ分别与对照品β-谷甾醇，过氧麦角甾醇，D-阿洛醇共薄层色谱检识Rf值相同，HPLC检识保留时间一致，因此，确定这3个化合物分别为β-谷甾醇，过氧麦角甾醇和D-阿洛醇。

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