李东，申元英

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）于1966年被发现，属于嗜肝 DNA 病毒科，是全球传染性肝病的主要病因之一。现已证明 HBV 除肝细胞外还有泛嗜性[1]，可存在于除肝脏以外的其他组织细胞中，外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）也是其靶细胞之一。由于PBMC是 T和B 淋巴细胞､巨噬细胞､NK 细胞等免疫活性细胞的集合体，其在机体免疫过程中具有重要作用，因此在PBMC 中发现 HBV DNA 及其对机体所产生的影响已引起国内外学者的广泛关注。现就近来感染 HBV的PBMC 相关研究进展进行综述。

1 HBV 对 PBMC 具有感染性

PBMC是一群在机体的免疫应答中起重要作用的单形核白细胞。1984年Oon和Ding[2]证实在淋巴细胞液和部分颗粒内可检测到 HBsAg和HBeAg的存在。其后，国内外的诸多学者运用 southern 杂交技术证实了乙肝及肝癌患者的外周血白细胞（包括淋巴细胞和单核细胞）内存在HBV DNA，并发现其存在形式分为整合型和游离型两种。由于白细胞对机体的免疫功能起着重要的作用，而在多数乙肝患者中又常出现免疫功能紊乱的表现，因此以上发现不但证明了白细胞能够被 HBV 感染，而且提示这可能是致使乙肝患者免疫功能紊乱的原因之一。HBV cccDNA 被认为是 HBV复制的模板，如果 HBV cccDNA 检测结果阳性，通常认为存在HBV的复制。近年来国内外研究报道 PBMC 可被HBV 感染，并且 HBV 可以在PBMC 中复制[3-6]。刘先进等[7]研究证实外周血白细胞中存在HBV cccDNA，并且慢性肝病患者外周血 HBV cccDNA 与血清 HBV DNA 含量存在一定关联。

2 HBV 存在于PBMC的意义

2.1 阐明 HBV的致病机制

目前的研究表明，HBV 感染的主要发病机制是病毒感染所致的免疫病理应答。免疫功能紊乱的现象常常存在于慢性 HBV 感染者[8]。PBMC 在机体的免疫调节中起重要作用。感染 HBV的PBMC 与患者体内的免疫功能紊乱是否存在相关性，已成为当前的研究热点。国内外学者研究报道PBMC 免疫功能紊乱与HBV的复制有明显关系，HBV 感染可能影响 PBMC 产生 IFN-γ的能力[9-10]。钟艳丹等[11]的研究结果初步说明 HBV 直接感染 PBMC 后，能使免疫细胞的功能改变，它可能是引起 HBV 感染后机体抗 HBV免疫功能低下、Th1/Th2 失衡，形成慢性乙型肝炎的发病机制之一。还有报道认为HBV 感染的PBMC 与HBV 隐性感染[12]及肝移植后HBV 再感染[13]有关。HBV 感染PBMC 对机体免疫功能的影响正越来越多地受到关注。

2.2 阐明 HBV的传播途径

大量研究表明，胎儿 PBMC 中 HBV 感染率与母亲、胎儿的病毒血症水平及母亲 PBMC 中 HBV DNA 状态有关[14]，提示我们 PBMC 中的HBV DNA 可能是 HBV 母婴垂直传播的一条重要途径。有研究者认为HBV 可能通过2 种途径感染胎儿 PBMC：一种是因为PBMC 有变形游走性，可在组织间隙自由移动，所以母亲阳性 PBMC 通过游走进入胎儿体内；一种是母血 HBV 经胎盘感染或渗漏进入胎儿体内，感染胎儿 PBMC 或通过感染胎儿骨髓干细胞、胸腺后，释放 HBV 感染的PBMC[15]。

黄敦武等[16]运用 PCR 法在慢性乙型肝炎患者 PBMC中检测出HBV DNA，并且还可以在中性粒细胞、T 淋巴细胞和非 T 淋巴细胞中检测出HBV DNA。从而推断，体液中含有白细胞，而带有 HBV的白细胞就成为传播的媒介。

2.3 监测 HBV 患者病情的可能指标之一

一般认为血清中 HBeAg 与HBV DNA是病毒复制的检测指标，后者通常在HBeAg 阴转时消失。李秀梅等[17]研究表明，血清中 HBV DNA(–) 并不完全意味着病毒的清除与复制水平降低或消失，并且有 PBMC 感染 HBV 者可出现血清 HBV 重新复制及致使肝功能再度受损的危险。有学者认为PBMC 可以作为HBV 肝外复制的场所和病毒的储存库，从中可以检出RNA 复制中间体、HBV 整合形式甚至 cccDNA[18]。很多研究证明血清 HBV cccDNA 可能不只是来源于肝组织。PBMC 中的HBV cccDNA 在一定程度上可代替肝组织 HBV cccDNA 用于检测、判断病毒复制。PBMC 中 HBV cccDNA、血清 HBV DNA 两者联合检测更能准确判断 HBV 复制率[19-20]，可以了解肝外组织或细胞是否存在HBV。

2.4 研究 HBV DNA的细胞模型

HBV 可以直接感染 PBMC，HBV DNA 可以在PBMC内复制与转录，HBV DNA 还可以整合到宿主 PBMC的基因组内。有研究表明在HBV DNA 转染 PBMC 成功后，细胞可产生全部病毒标志物、复制中间体、转录体及22 nm球形 HBsAg 颗粒。邢益平等[21]构建了乙型肝炎患者外周血 PBMC 体外培养体系，并且在该细胞系的上清液和培养细胞中均检测出HBV DNA。该研究提示培养细胞中有HBV 复制，且能将病毒分泌到上清液中，这表明该培养系统基本代表了 HBV 在体内感染、复制和分泌的全过程。陈丰哲[22]研究报道了 HBV 核心蛋白及X蛋白可以在长期培养的PBMC 中稳定表达，这也表明 PBMC 可以作为HBV 体外表达的细胞模型。

另有资料表明，PBMC 中的不同亚群都可以感染HBV，感染率由高至低依次为：单核细胞、B 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞、NK 细胞和CD4+T 淋巴细胞[23]。目前，国内很多学者都用永生化 B 淋巴母细胞作为宿主细胞构建 HBV的真核表达体系。例如，张明霞等[24]研究建立了慢性乙型肝炎患者永生化的B 淋巴母细胞系，并且稳定表达了 HBV 全基因 c 区突变株，为体外研究 HBV 特异性免疫应答提供了刺激细胞和靶细胞。

3 PBMC 中 HBV DNA的常用检测技术

以往大多文献报道常用于检测乙肝患者 PBMC 中HBV cccDNA的方法是蛋白免疫印迹法（southern blot），该方法是分子生物学的经典方法，其检测结果较为准确，但是存在敏感性偏低且不能准确定量，操作比较繁琐，所需标本量较大等缺点。相反，聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术具有敏感、快速、特异性强等优点，现已被广泛用于HBV DNA的相关检测与研究中。目前国内外针对 PBMC 中 HBV DNA 常用的检测方法还有：荧光定量 PCR 技术、PCR-微流芯片技术等。

3.1 荧光定量 PCR 技术

荧光定量 PCR 技术是指在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[25-26]。其融合PCR和荧光探针杂交技术的优点，直接探测 PCR 过程中荧光信号的变化，根据 PCR 反应的酶动力学特点，获得DNA 模板的准确定量结果。该技术便于研究者实时观测PBMC 中 HBV DNA的含量。

3.2 PCR-微流芯片技术

PCR-微流芯片技术是一种新型芯片检测方法，结合凝胶电泳分离荧光检测，具有较高灵敏度和实用性。其通过荧光检测识别不同大小的DNA 片段，并以数字化形式输出PCR 产物大小等信息，这些图形直观，结果易判断，除用于研究外，还可用于献血者的定性筛查等。该方法同时设有内对照体系，与靶基因在同一系统进行提取、扩增和检测，可以有效监测整个体系，防止假阴性产生，HBV DNA 检测灵敏度和重复性可达到较高水平，相比其他同类方法，具有较大的应用推广价值[27]。

4 展望

综上所述，PBMC 可被 HBV 感染，并且 HBV 可以在PBMC 中复制。PBMC 包括多种免疫细胞，对机体的免疫功能起重要作用，感染 HBV的PBMC 功能如何改变，对机体的免疫反应产生何种影响是目前的研究热点也是研究难点。研究 PBMC 内感染 HBV 有助于阐明 HBV的致病机制，了解 HBV 在体内的传播途径，并为HBV 患者的病情诊断提供更充足的依据，为乙肝患者的治疗提供新的思路和方法。同时，关于感染 HBV的PBMC 还有很多问题需要我们进行大量的研究来解释。其中，PBMC是否为除肝组织以外的HBV的另一个复制场所和病毒储存库，目前尚未有明确定论；慢性乙型肝炎患者出现的免疫功能低下和紊乱是否与HBV 直接感染免疫细胞有关，还有待进一步研究；PBMC 感染 HBV 后细胞因子的分泌水平如何发生变化及其改变机制，也需要更多的研究从而阐明。

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