朱 翔 综述 董 扬 审校

骨肉瘤分子边界相关标记物的研究进展

朱 翔 综述 董 扬 审校

骨肉瘤边界包含着丰富的肿瘤病变的特征信息，对疾病的分类、临床治疗方案设定、疾病预后具有重要意义。分子生物学和基因组学研究的不断深入，为骨肉瘤的分子边界研究提供了理论基础，并且为检测分子边界相关标志物提供了必要的技术手段，一些新的分子标记物也随之被提出并研究。本文就目前相关领域的骨肉瘤分子边界相关标记物进行综述。

骨肉瘤 分子边界 标记物

骨肉瘤是最常见的骨原发性恶性肿瘤，好发于青少年，恶性程度高，预后差，是严重影响青壮年健康的恶性肿瘤。目前，保肢手术是治疗骨肉瘤的最主要手段之一，而术后局部复发是手术治疗失败和影响疾病预后的重要原因。因此，手术切缘彻底与否成为影响预后的主要因素，如何获得安全的手术切缘目前仍存在较大争议。传统方法判断手术切除是否干净主要基于对切缘组织的常规病理学 （即细胞形态学）观察，然而在病理学诊断为切缘阴性的患者中，仍有10%～30%出现了局部的复发[1]。常规病理学的局限性在于对形态上（或表型上）与正常细胞无可见差异的癌前细胞或具有潜在转化能力的“正常”细胞没有区分能力；当正常细胞中只有少量癌细胞或微癌灶只存在于切缘组织的某个区域时，极易造成漏检。事实上，骨肉瘤在细胞形态发生明显变化之前，其分子水平及生化代谢水平已发生异常改变，出现功能异常的癌基因产物。分子生物学和基因组学研究的不断深入，为骨肉瘤手术切缘的分子边界研究提供了理论基础，并且为探讨分子边界提供了必要的技术手段，一些新的分子标记物也随之被提出并研究。现将与骨肉瘤手术切缘相关的一些分子标记物及其研究现状综述如下。

1 p16基因

p16是一种新型抑癌基因，位于人类染色体9p16区，与细胞周期调节密切相关，该蛋白是CDK4的抑制因子，通过与细胞周期蛋白D1以竞争方式结合CDK4，抑制CDK4的活性，使细胞停滞于G0期和G1期，抑制细胞分裂增殖。CDK4可调节多种底物的磷酸化，是G1/S期和G2/M期转换的关键。体外研究证实，p16蛋白能特异地抑制CDK4的活性。细胞周期蛋白D表现为某种癌基因的作用，当其过度表达时，细胞便会向癌细胞发展。细胞周期蛋白D同CDK4结合时，可刺激细胞生长分裂；p16与CDK4结合时，致使其磷酸化活性降低，引起Rb磷酸化而导致肿瘤细胞死亡。因此，p16既是细胞周期固有的调控者，又是抑制肿瘤生长的关键成分。

王海涛等[2]发现，骨软骨瘤中 p16 mRNA的表达显著高于骨肉瘤。这说明p16表达降低有可能使癌细胞获得某种生长优势，预示这些患者预后不良。该研究同时检测了骨肉瘤和肉瘤旁组织PTEN、p16、Rhoc等表达情况，分析癌瘤向周边浸润及周围组织癌变趋向的规律。结果显示，距原发病灶越远，PTEN、p16、Rhoc阳性的比例逐渐降低，癌旁发生高危病变的几率降低（P<0.05）。李文辉等[3]的实验发现，p16在骨肉瘤组织中阳性率为36.67%，认为p16基因的缺失可导致p16蛋白定量、定位或结构的改变，造成p16蛋白功能异常，从而导致抑癌功能失活。

2 Survivin基因

Survivin基因是新近分离鉴定的凋亡抑制蛋白（Inhibitorof apop tosis，IAP），在人类大多数肿瘤组织中高表达，而在正常成人组织中不表达，因其具有独特的结构和分布而区别于其他凋亡抑制基因[4]。Survivin编码产生含142个氨基酸的蛋白，能直接抑制 Caspase蛋白酶活性而抑制细胞凋亡。Survivin是细胞周期G2/M期的重要调节因子，与其他细胞周期G2/M期检测点的调控基因具有协同作用，以保证细胞复制的忠实性[5]。其过量表达可导致肿瘤细胞逃避细胞周期检测点，从而使肿瘤细胞逃避凋亡，异常增殖，导致肿瘤的形成。

Survivin在绝大多数分化成熟的组织（除胎盘等）中不表达或低表达，而在胚胎组织以及大多数实体瘤组织中高表达。杨宝军等[6]的实验证明，Survivin表达于骨肉瘤细胞浆，少量可见细胞核表达，同时发现Survivin胞核表达在部分肿瘤中临床意义高于细胞浆。Survivin在38例骨肉瘤标本中阳性率分别为44.7%（17/38）和55.3%（21/38）。Survivin的表达与患者年龄、性别、骨肉瘤亚型无明显关系，但与Enneking外科分期有关，Ⅰ～ⅡA期与ⅡB～Ⅲ期之间的肿瘤Survivin表达率差异明显（P＜0.05）。众所周知，Enneking外科分期越高，患者预后越差，生存期越短。根据上述研究提示，Survivin可作为判断患者预后的指标。

3 CRM1蛋白

CRM1蛋白是体内一类重要的核输出受体，CRM1蛋白参与细胞核-胞质转运，并在有丝分裂中发挥重要作用。有研究发现，在细胞有丝分裂过程中，CRM1能和RAN2GTPase酶协同作用，调节有丝分裂中诸多重要环节，提示CRM1蛋白很可能参与了恶性肿瘤的病因学进程[7]。何忠惠等[8]研究检测并分析了57例CRM1蛋白在骨肉瘤瘤组织和正常组织中的表达情况，发现CRM1在骨肉瘤组织中的表达较正常组织中明显升高，伴有CRM1蛋白高表达的患者预后较差。该研究同时发现，CRM1的高表达和血清内ALP的升高密切相关。

4 CD44

CD44是一种细胞表面黏附分子，主要参与细胞和细胞、细胞和基质之间的特异性黏附过程，与细胞的运动、肿瘤的发生浸润和转移密切相关。其基因按外显子的表达方式不同可分为标准构型CD44s（Standard form）和变异型 CD44v（Variant isoform）。应用基因分析手段检测CD44基因在手术切缘处的变化情况，对于判断术后效果、评估预后及确立手术切缘的分子边界都具有重要的意义。

Femandez等[9]研究发现，肿瘤组织CD44s水平明显高于肿瘤周边黏膜组织，两种组织的CD44s水平在高S期肿瘤中明显高于低S期肿瘤。肿瘤组织CD44s水平和患者预后无关，然而肿瘤周边非肿瘤黏膜的高CD44s水平和患者预后不良显著相关。提示CD44可能在肿瘤生长中起一定作用，肿瘤周围黏膜的CD44s水平可成为确立手术切缘分子边界的标志物之一，且在评估肿瘤患者预后中发挥重要作用。李成存等[10]发现，骨肉瘤组织中 CD44的阳性表达率显著高于骨软骨瘤及正常骨组织；其表达与骨肉瘤临床分期、肿瘤转移及2年内死亡有关，而与患者性别、年龄、肿瘤大小、病理分型、术前化疗无关；CD44阳性表达者与阴性表达者的肿瘤转移率有显著性差异。

5 MTA1基因

肿瘤转移相关基因1（Metastasis associated 1，MTA1）是新近发现的一个肿瘤转移相关基因，其表达与许多恶性肿瘤的浸润转移能力呈正相关。MTA1促进恶性肿瘤转移的分子机制可能与组蛋白去乙酰化转录调节有关。组蛋白末端乙酰化能中和组蛋白中的阳离子，从而降低DNA与乙酰化区域的结合，打开染色质结构，促进转录；相反，组蛋白去乙酰化使染色质结构变得紧密，抑制转录。

李新志等[11]通过应用半定量RT-PCR检测高转移性骨肉瘤细胞株和低转移性骨肉瘤细胞株中MTA1的表达水平，发现高转移性骨肉瘤细胞株中MTA1的表达水平明显高于低转移性骨肉瘤细胞株，有统计学意义，表明 MTA1基因表达水平与骨肉瘤细胞的侵袭、转移潜能相关。为了进一步证明MTA1促进骨肉瘤转移的作用，该研究还通过真核表达质粒转染MTA1基因到低转移性骨肉瘤细胞株，使之能稳定表达MTA1，可以检测到低转移性骨肉瘤细胞株在转染后侵袭能力显著性增加。步国强等[12]用免疫组化技术证实MTA1蛋白主要表达于细胞核和细胞浆，与Moon等[13]的报道一致。该研究认为MTA1的表达与患者的性别、年龄、发病部位、发病-就诊时间及肿瘤的体积均无相关性。

6 端粒酶

端粒酶是一种核糖核蛋白体，具有逆转录酶活性，它能以自身的RNA组分为模板合成端粒，以补偿细胞分裂时染色体端粒的缩短，使得端粒的长度得以维持，从而逃避了因端粒缩短而引起的细胞死亡，使细胞获得“永生化”。正常人体细胞很少能检测出端粒酶活性的表达，而100%的肿瘤细胞株及大多数肿瘤组织中的端粒酶活性却有异常表达。端粒酶已被认为是迄今为止最有特异性和敏感性的肿瘤标志物和抗肿瘤治疗的新靶点之一，因此检测其活性和端粒的长度可用于估计癌变的潜能和趋势、观察疗效及预后。

叶哲伟等[14]用原位分子杂交检测骨肉瘤组织中各种细胞成分端粒酶hTERT的表达，结果显示，端粒酶hTERT基因在骨质增生骨组织、异位骨化组织和正常骨组织中的表达均为阴性。而52例骨肉瘤中，43例（82.17%）有端粒酶hTERT基因表达；在分布上，端粒酶hTERT阳性表达水平与肿瘤细胞的分布定位一致，hTERT均位于肿瘤细胞的胞质中，这与hTERT的生化特征和功能是一致的。一方面说明原位分子杂交对于骨肉瘤细胞水平检测端粒酶hTERT基因的定位诊断具有重要意义，另一方面说明在骨肉瘤的发展和维持中端粒酶可能起到重要的作用。

7 Rb2/p130基因

Rb2/p130基因是在1993年被发现并克隆成功的一个抑癌基因，属Rb基因家族，它所表达的蛋白质 Rb2/p130通过维持细胞周期G0期细胞的转录静止来促进细胞的分化与成熟，从而抑制细胞的恶变。它在人体内的各种正常组织中具有广泛的表达。Rb2/p130基因发生异常或缺失与多种肿瘤的发生、发展密切相关。

李世德等[15]的实验表明，骨肉瘤标本中Rb2/p130基因有一定程度的表达，但明显低于骨软骨瘤与正常骨组织，并且Enneking临床分期越低的骨肉瘤标本中，Rb2/p130基因表达也越低，这些都说明了Rb2/p130基因作为抑癌基因在骨肉瘤中表达下降，从而失去维持G0期细胞的转录静止及其对细胞周期的负性调控作用，使DNA合成增加，大量细胞进入S期，造成细胞异常增殖，导致肿瘤发生发展。Rb2/p130表达下降也使其促进细胞分化功能下降，使分化低的骨肉瘤细胞增多，是骨肉瘤发生发展、侵袭性强、预后不佳的重要原因之一，亦可作为骨肉瘤预后评价的参考指标之一。

综上所述，骨肉瘤保肢手术治疗的原则是彻底切除原发病灶，获得阴性切缘。如何确立一个真正安全的手术切缘，对患者的局部复发和预后均起到了关键作用。常规病理学检测出的癌细胞阳性切缘与切缘中仅有分子生物学变化者不同，后者仅有基因改变而无形态学改变，可能处于肿瘤发生的早期阶段，这有可能成为肿瘤复发的根源。对手术患者切缘进行分子生物学检测，确定其手术切缘的分子边界，可对患者进行及时的干预，以提高其生存率。因此，常规的病理学检查结合分子生物学检测可提高手术切缘诊断的敏感性，对预防患者术后复发和评估预后都具有重要的意义。从分子水平重新评价和确定骨肉瘤的手术切缘，亟待深入探究。

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Advancement on Markers of Molecular Margins in Osteosarcoma

ZHU Xiang,DONG Yang.

Department of Orthopaedics,Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200233,China.

【Summary】The margins of osteosarcoma contain large amount of information about tumor lesions.The information is important to classify the characteristics of tumors,determine therapeutic plan and forecast prognosis of patients.The deepenings of recent advances in molecular biology and genomics not only provide theories for the research of molecular margins in osteosarcoma but also furnish necessary technical means for testing Molecular Margins.Some new molecular markers have been proposed and studied.The new Markers of molecular margins in osteosarcoma will be reviewed in this article.

Osteosarcoma;Molecular margins;Markers

Q813.1+2

A

1673-0364（2011）04-0181-05

2011年4月3日；

2011年4月26日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.05.001

200233 上海市 上海交通大学医学院附属第六人民医院骨科。