向萌娟 综述 杨 斌 审校

·综述·

毛囊干细胞定向分化过程中Wnt信号通路介导的基因调控

向萌娟 综述 杨 斌 审校

皮肤的毛囊干细胞具有自我复制以及多向分化潜能，在毛囊形态发育和定向分化过程中，Wnt信号通路起决定性作用。参与这条信号通路的重要蛋白质，如Wnt蛋白、Frizzled、β-catenin、GSK3β、APC、Axin等研究相对较早，且颇为深入。但对于这条通路下游的调节因子，尤其是细胞核内关键性转录因子Tcf3、Lef1，以及它们所调控的一些重要基因c-myc、cyclinD1等的研究仍处于起步阶段。本文就Wnt信号通路介导的基因调节毛囊干细胞定向分化的研究现状进行综述，为构建组织工程皮肤提供理论参考。

毛囊干细胞 Wnt信号通路 基因调控

皮肤细胞每天都在不停地更新。表皮层细胞凋亡脱落，由表皮基底层干细胞不断产生新的细胞上移补充，干细胞逐渐演化成终末细胞，增殖与分化之间保持着相对平衡。表皮含有两种可增殖的角蛋白细胞，即干细胞（Stem cell）和短暂扩充细胞（Transit amplifying cells，TAC）。干细胞也称标记储留细胞（Label-retaining cell，LRC），是一类具有无限自我更新和高度增殖能力的细胞群。短暂扩充细胞由干细胞分化而来，并能进一步分化成终末分化细胞而退出细胞周期[1－2]。以往的研究基本明确了毛囊干细胞的定位、特异性标记物、生长微环境等[3-5]。但毛囊干细胞是如何定向分化的？生物信号如何调节基因表达来控制毛囊干细胞的命运？本文就毛囊干细胞定向分化中Wnt信号介导基因调控的研究进展进行综述。

1 Wnt信号通路

1.1 Wnt信号通路的概述

Wnt信号通路包括经典Wnt信号通路，即Wnt/β-catenin信号通路；以及10个非经典Wnt信号通路：Wnt/PCP信号通路、Wnt-cGMP信号通路、Ca2+信号通路等。参与毛囊干细胞增殖分化的信号通路主要为经典Wnt信号通路。在胚胎的生长发育以及成体干细胞的增殖分化过程中，这条通路将细胞外或细胞间的信息传递到细胞核内，并通过一系列级链反应影响着基因的表达，从而对细胞的分化方向、细胞增生、细胞极性及迁移、细胞老化等进行调控。不仅如此，最近的研究还表明，Wnt信号通路在调节干细胞多能性以维持机体内稳态上也发挥了关键性的作用[6]。

1.2 Wnt蛋白及β-catenin

Wnt蛋白家族是一个及其复杂庞大的信号系统，包含有多个亚类。哺乳动物有19个Wnt蛋白基因，可以产生12个Wnt蛋白亚家族[7]。人类至少存在有19个Wnt家族成员，其中包括Wnt-3、4、5a、6、7a、7b、10a、10b、11等。Wnt蛋白进入细胞内引起级链反应的关键分子之一便是β-连环蛋白 （βcatenin）。β-catenin是 1980年Walt Birchmeier在研究细胞黏附分子—E-钙粘连素 （E-cadherin）相关分子时首次发现的。β-catenin基因位于3p21，由CTNNB1基因编码，其产物在人体的相对分子质量约92 KDa。从低等动物果蝇至哺乳动物和人类，其同源性高达80%，具有高度的进化保守性。βcatenin有 3个重要的功能域：N末端为糖原合酶激酶 3（GSK3β）磷酸化降解区，对于调节 β-catenin的稳定性有重要作用；C末端是转录激活域，可与转录活化因子TCF/LEF结合；中间的连接臂重复区是arm重复域，是β-catenin与多种配体如肿瘤抑制基因结肠腺瘤息肉病基因蛋白 （APC）、轴素（Axin)、E-钙粘连素等结合的重要部位。

已有的研究表明，β-catenin在毛囊干细胞的激活及定向分化中起关键作用。β-catenin具备两方面的生物学功能，黏合连接与信号转导[8]。Wnt信号通路静止时，β-catenin只参与细胞间的黏合连接；当Wnt信号通路启动时，β-catenin起核心信号分子作用。毛囊干细胞内表达高水平的β-catenin时，干细胞分化成为毛囊结构的细胞，而低水平的β-catenin将使毛囊干细胞分化成为表皮细胞。此外，有研究表明，成人表皮中的β-catenin被激活后，会有新的毛囊形成[9]，而在毛囊隆突部干细胞群的β-catenin表达沉默后，会引发毛囊干细胞向表皮细胞转归。有研究认为，通过转基因表达[10]或者创伤而提高稳定的β-catenin含量，也将诱导皮肤产生新的毛囊；反之，丢失β-catenin后毛囊也随之缺失，皮肤肿瘤生长受到抑制[11]。

1.3 Wnt蛋白与受体的相互作用及信号通路

在经典Wnt信号通路中，无Wnt信号刺激时，细胞质中的β-catenin与Axin、GSK3β、APC、酪蛋白激酶1（Casein kinase 1，CK1）等结合在一起构成降解复合体，β-catenin的第41、37、33位残基被GSK3β丝氨酸/苏氨酸磷酸化，第45位残基被CK丝氨酸/苏氨酸磷酸化，受到泛素的共价修饰而被蛋白酶降解，从而保持了胞内低水平的β-catenin。随着Wnt蛋白的增加，Wnt蛋白与细胞膜上跨膜的卷曲蛋白受体Frizzled（FZ）及低密度脂蛋白受体相关蛋白（Low density lipoprotein receptor-related protein，LRP）结合，激活了细胞质中的散乱蛋白（Dishevelled，DSH）。DSH与Axin作用并添加上其它蛋白质，如GSK结合蛋白 （GBP/FRAT）以及蛋白磷酸化酶2C，抑制了Axin·APC·GSK3β复合体的形成，降低了GSK3β的活性，抑制β-catenin的磷酸化，阻断细胞质中的泛素-蛋白酶小体对游离β-catenin的降解，从而引起细胞质内βcatenin的水平升高。细胞质内低磷酸化的β-catenin聚集，浓度升高进入细胞核，与T细胞因子（T cell factor，TCF）/淋巴样增强因子（Lymphiod enhancer factor，LEF）形成复合体，作为细胞核转录激动剂来调节靶基因的转录。

2 Wnt信号通路介导的基因调控

TCF/LEF转录因子家族是含有HMG结合域的DNA连接蛋白，为Wnt信号通路重要的下游效应因子。大部分TCF/ LEF分子含有3个主要的结合域：N端的β-catenin结合域、Groucho/TLE结合域以及连接DNA的HMG结合域。在Wnt信号通路中，Wnt蛋白存在时，β-catenin转移定位于细胞核，替换掉结合在TCF/LEF上的四聚物Groucho（Grg/TLE），形成β-catenin-TCF/LEF二聚体，并能引导更多的激活因子聚集在该二聚体上，激活下游靶基因c-myc、cyclin D1、Tcf1和PPARδ等的转录与表达，调节细胞的增殖和分化，调控细胞的命运。但在替换过程中，能否形成β-catenin-TCF/LEFGroucho/TLE-DNA中间态复合体，目前仍没有明确的报道。

2.1 Wnt信号通路下游的重要转录因子

脊椎动物TCF转录因子家族成员包含4个：Tcf1、Lef1、Tcf3和Tcf4[12]。在毛囊的诱导分化中起到重要作用的是Tcf3和Lef1。Tcf3在隆突部（Bulge）及外根鞘（ORS）下份的干细胞中表达丰富且含量不同，Bulge区干细胞通常只表达Tcf3而不表达Lef1，毛囊干细胞呈现静止状态，而ORS中的毛囊干细胞表现出激活的状态，能进一步作为替补细胞出现在毛囊的基底层，形成基底细胞和毛发[13]，Tcf3在ORS中表达相对减少；Lef1则主要表达于毛囊基底细胞中，这些细胞可定向分化为短暂扩充细胞、前皮质细胞，长出毛发。当隆突部细胞向毛囊基底细胞分化时，TCF3丢失，而LEF1表达出现，这一转变似乎在干细胞向毛发细胞分化的过程中是必须的，可能与接受了Wnt信号传导有关。

当稳定表达的β-catenin水平增加时，干细胞激活，许多细胞增殖相关的基因表达随之上调，毛囊毛发生长发生[14]。大量的实验证明，Tcf3在缺乏Wnt信号的情况下，可抑制毛囊干细胞的定向分化，使毛囊干细胞保持其多向分化潜能；Wnt信号参与时，Tcf3则能介导毛囊干细胞分化。Lef1必须在有Wnt信号存在的情况下才能发挥作用，促进毛囊干细胞分化成为构成毛囊结构的细胞，在毛囊的形态发生中起着至关重要的作用。异位诱导Tcf3表达于表皮的基底层，将会抑制表皮基底层细胞分化为表皮细胞，并能改变转录使之成为类似于胚胎的非定向分化的表皮结构[15]。另外，Tcf3在细胞周期中也起到减慢细胞循环的作用。Lef1的显性负突变能够导致Lef1或β-catenin过度表达，然后引起 β-catenin信号通路阻断，对Wnt信号通路产生负性调节作用，抑制毛囊滤泡分化，导致毛囊形成异常；但却促进了毛囊干细胞向皮脂腺和毛囊滤泡间上皮分化。同时，过度表达的Lef1还可引起毛囊肿瘤的发生[16]。

Tcf3能抑制Wnt信号通路靶基因的转录，保持毛囊干细胞多向分化能力的特性，可以通过其他一些标记物的共同表达得到进一步的说明。在一些动物模型中，表达Tcf3的表皮还能出现K5、SOX9等相对未分化形态学的阳性表达，说明Tcf3能保持细胞的干性。Tcf3的这些作用也可用来解释为什么Tcf3局限于毛囊的Bulge区表达，这与Bulge区细胞的自我更新、慢周期特性是一致的。

Lef1和β-catenin在毛囊的形态学发生中起着重要的作用。早在1994年，就有研究发现Lef1阴性的大鼠表现出毛囊的缺乏。进一步研究发现，利用角蛋白14（Keratin 14）为启动子载有 Lef1基因的载体在转基因大鼠的表皮、ORS以及Bulge区表达Lef1以后，在表皮也能观察到类似于毛芽样的内陷，即产生了代表毛发的信号。当以同样方法利用K14为启动子表达结构稳定的 β-catenin（ΔN87β-catenin）以后，来自于表皮、ORS以及Bulge区的细胞发生毛囊样分化，并有毛囊形态学发生。在这些转基因大鼠中，Lef1的表达与毛囊干细胞向毛囊毛发分化是一致的，说明了Lef1对于毛囊干细胞定向分化的调节起到至关重要的作用。

最近的研究发现，无论是在胚胎祖细胞还是出生后的毛囊干细胞中，Tcf4与Tcf3都是共同表达的，而且Tcf4的表达位置和作用都与Tcf3一致，都能抑制毛囊干细胞的分化，保持毛囊干细胞的多能性[17]。

在人类和鼠科动物中，编码的Groucho蛋白同系物分别被命名为TLE1-4、hAES和Grg1-5，其中TLE1-4与Grg1-4包含Goucho蛋白全长的5个结构域，即Q、GP、CCN、SP和WD40，而hAES和Grg5只有Q、GP两个结构域。Goucho蛋白通过其N末端Q域的亮氨酸拉链组成四聚体结构，可与组蛋白去乙酰化酶相互作用。在核内没有β-catenin的情况下，Groucho连接在TCF/LEF上，聚集的组蛋白去乙酰化酶会使染色质更加紧密而失活。当Wnt信号存在时，β-catenin在核内聚集，与β-catenin的酸性 C末端直接相连的蛋白CBP/ p300[18]发生反应，CBP/p300有组蛋白乙酰化酶活性，可使连接在TCF/LEF上的DNA激活，抵消Groucho/TLE的作用[19]，协助β-catenin转录下游靶基因。近年来的研究发现，CtBP既可作为共激活因子也可作为共抑制因子，它表现出什么样的活性依赖于细胞的表型，但这一系列反应的具体过程目前仍不清楚。

2.2 TCF/LEF与β-catenin

Merrill等[20]的转基因小鼠实验中，无论是野生型的TCF3，还是N端β-catenin结合域缺失的TCF3（ΔNTcf3），均能起到相同的作用，即抑制靶基因的转录产生相同的表型，说明Tcf3的作用可能并不依赖于β-catenin信号。Merrill等[21]的胚胎实验也发现，在胚胎的形成过程中，Tcf3与TCF/LEF家族的其他成员是不相同的，无论有没有Wnt信号，Tcf3均可发挥其调节基因的作用。但与TCF3不同的是，Lef1对于转录的激活必须依赖Wnt信号及稳定的 β-catenin存在。N端βcatenin结合域缺失的Lef1（ΔN Lef1）由于无法与β-catenin结合，阻止了Lef/Tcf的激活功能，毛发形成被终止，代之形成皮脂腺细胞。

目前对于β-catenin是如何进入细胞核内的机制尚不明确。但通过使TCF过度表达发现，当存在有大量TCF时，βcatenin进入细胞核内变得相对容易。利用逆转录病毒转染角化细胞，使细胞表达不同的β-catenin突变体。研究结果表明，氨基酸截短的β-catenin突变体（因没有GSK3结合位点而不被降解）可增加培养细胞中干细胞克隆的比例，而且这种作用与TCF/LEF转录因子活性改变密切相关。当转基因小鼠表皮基底层过度表达氨基酸截短的β-catenin时，基底细胞呈现多能干细胞的特征，并可分化形成毛囊和表皮。相反，干细胞中β-catenin表达减少时，则无法分化形成毛囊中的角化细胞，而只向毛囊之间分布的表皮方向发展。虽然βcatenin/TCF3、β-catenin/LEF1复合体与毛囊干细胞增殖、分化间的关系已有了初步的认识，但其潜在机制及功能重要性仍有待进一步研究阐明。

2.3 TCF/LEF调节基因转录的影响因素

细胞质与细胞核中catenin伴侣分子的相互竞争影响着TCF/LEF与β-catenin之间的连接。钙黏素的胞外部分含有五个与Ca2+连接的结构域，与相邻的细胞紧密连接，而其胞内部分则与 β-catenin、α-catenin、γ-catenin、 细胞骨架及catenin p120紧密连接。过度表达钙黏素将导致大量的βcatenin之间及β-catenin和钙黏素之间相互黏连，这样就减少了β-catenin进入核内与TCF/LEF形成复合体的机率，转录受到抑制，靶基因的表达减少。生长因子受体及酪氨酸激酶可以下调钙黏素的转录水平或分解钙黏素/catenin复合体，从而使β-catenin与E-钙黏素和细胞骨架脱离，细胞间黏附减弱，有利于Wnt信号的转导及细胞的迁移和分化[22]。

转录因子之间也存在着竞争。β-catenin除了与TCF/LEF结合外，其他的一些活性域可与另外的转录因子相结合。如HGM活性域可与SOX亚家族的转录因子成员结合，而Arm重复序列区则能与视黄醛受体（RARα）结合。TCF/LEF家族成员种类繁多，作用各不相同，其成员之间与β-catenin的竞争也是影响转录的重要因素。另外，与β-catenin高度同源的plakoglobin(γ-catenin)也可竞争性地结合转录因子。

ILK（integrin-linked kinase）可以与 β-catenin结合而发生作用，从而调节β-catenin从胞浆转运到核内的过程，下调GSK-3β的活性，下调E-钙黏素导致β-catenin的重新分布，ILK还能参与调节Lef1的表达[23]。一些外来因素，例如角质细胞生长因子（KGF）、氯化锂（LiCl）等也可与TCF/LEF发生作用影响靶基因的转录。Fathke等[24]通过采用小鼠背部全厚皮肤缺损的模型，检测在创伤修复过程中不同时间段的Wnt蛋白表达情况，并用β-gal报告β-catenin的表达，发现LiCl可抑制GSK3β的活性，从而激活β-catenin/Tcf信号通路，部分样本观察到皮肤附属器的形成，包括简单的毛囊和皮脂腺结构。

3 Wnt信号通路中的关键调控基因

3.1 c-Myc

c-Myc是原癌基因Myc家族中的一员，基因定位于8号染色体长臂上（8q24），编码由349氨基酸组成的蛋白质。其编码的蛋白质能与核内的DNA特异结合行使转录调节功能。c-Myc是Wnt信号通路下游的靶基因，在毛囊上皮的基底膜和毛囊隆突部高表达。当β-catenin信号到达时将促进c-Myc基因表达的启动，使细胞从G1期向S期转变，调节细胞周期、抑制β1整合素的表达。在无干细胞存在的其他上皮如滤泡间上皮中，过度表达的Myc则能诱导增殖，抑制分化。简言之，c-Myc在毛囊干细胞中表达可促进细胞分化成为皮脂腺和表皮[25]，而在其他类型细胞中则促进细胞生长、增殖和凋亡。毛囊干细胞在其微环境中的正常存在依赖于c-Myc的正常表达，c-Myc转录水平的下降会导致干细胞衰竭，使干细胞无法参与创面修复过程；而其高表达则抑制角质形成和创面修复过程[26]。采用转基因大鼠c-Myc-ERTM过量异位表达人的c-Myc基因于毛囊和表皮的基底层，发现这些转基因大鼠表皮增厚，皮脂腺增大，毛发周期失调[27]。表明c-Myc基因的失控会使干细胞脱离微环境分化成短暂扩增细胞，从而影响皮肤及其附属器官的正常更新。

c-Myc在不同的细胞中其表达量也不相同。在毛囊干细胞中表达较低，在短暂扩充细胞中表达水平较高，然而到了终末细胞时，其表达水平及转录的mRNA数量又下降。这样才能确保TAC能够继续进入细胞周期，进行数次快速分裂，扩充细胞数量，并刺激其分化成为终末细胞[28]，而c-Myc低表达的终末细胞分化能力下降。这也可用来解释毛囊干细胞与短暂扩充细胞相比，更具有多向分化潜能，而终末分化细胞的分化潜能已经丧失。

由于c-Myc原癌基因启动子上有Tcf4结合位点，Wnt信号转导通路中的关键组分β-catenin还可能通过与TCF4的结合，而启动c-Myc原癌基因诱导干细胞分化，这与上述Wnt信号转导通路中β-catenin主要促使干细胞的增殖作用之间似乎相互矛盾，故而可以推测两者之间可能存在特殊的反馈环路[29]。另外，大量动物模型证明c-Myc与β-catenin之间存在着相互排斥的作用。这与c-Myc基因激活促进毛囊干细胞向皮脂腺和毛囊间表皮分化，β-catenin诱导新生毛囊发生是一致的[30]。

3.2 cyclin D1

细胞周期蛋白D1（cyclin D1）是调节细胞进入细胞周期增生期的主要因子，通过相应的周期素依赖性激酶（在皮肤主要为CDK4、CDK6）及其抑制因子对细胞周期关键限制点的G1/S转换起正性调节作用，促进细胞由静止期进入增殖期，激活干细胞使之增殖、分化。cyclin D1基因也是 βcatenin/Lef1复合体的目的基因，Lef1分子上含有 cyclin D1结合位点，与cyclin D1的启动子结合激活cyclin D1基因的表达以及细胞的增殖。通过在毛囊基底及基底以上区域取样进行一系列研究发现，cyclin D1编码的mRNA在整个基底上区层都高于基底区，而且在免疫组化染色中这一差异呈线形，说明cyclin D1介导的细胞增殖主要发生在最接近Bulge区的细胞，同时也能说明cyclin D1在细胞退出干细胞环境的过程中发挥着重要的作用[31]。cyclin D1合成异常将会导致细胞生长循环即使在没有生长因子的情况下也能发生，并能启动其他原癌基因的表达。cyclin D1蛋白含量的高低是由多种因子共同调节的，主要通过泛素的靶向降解而减少，过度表达β-catenin可诱导cyclin D1的活性，然而过度表达钙黏素的胞浆区则能减弱其活性。有研究表明，在转基因小鼠的表皮单独表达过量cyclin D1、D2或D3，仅仅只会导致表皮的增生，而不会产生肿瘤。

4 展望

毛囊干细胞作为种子细胞应用于组织工程中，构建具有生物活性的皮肤，并应用于临床以治疗脱发、烧创伤、瘢痕性秃发等毛囊皮肤缺损，已经成为近年来研究的热点。对于毛囊干细胞的研究，大多数研究都致力于定位、鉴定及增殖分化等，生物信号介导基因调控其定向分化的研究还处于初始阶段。Wnt/β-catenin-TCF/LEF路径是毛囊干细胞重要的生长调控信号，Wnt信号通路中各种生物大分子、受体、配体和无机分子之间相互作用而产生的生物学效应，TCF/LEF以及下游调控的靶基因c-Myc、cyclinD1的表达对于干细胞的增殖都具有极其重要的作用。随着基因组研究、基因工程技术的不断进步，将能够进一步解释毛囊干细胞基因表达调控机制从而通过有效的方法使其向人们需要的方向分化。

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Gene Regulation by Wnt Signaling Pathway in the Oriented Differentiation of Hair Follicle Stem Cells

XIANG Mengjuan1,YANG Bin2.1 GuangZhou Medical University,Guangdong 510182,China;2 Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100144,China.Corresponding author:YANG Bin(E-mail:ybdoctor_psh@163.com).

Hair follicle stem cells; Wnt signaling pathway; Gene regulation

Q813.1+2

A

1673－0364（2011）04－0181－05

2011年7月11日；

2011年8月20日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.05.001

国家自然科学基金（30772099），北京市自然科学基金（7112111）。

510182 广东省广州市 广州医学院 （向萌娟）；100144 北京市 协和医学院中国医学科学院整形外科医院（杨斌）。

杨斌（E-mail:ybdoctor_psh@163.com）

【Summary】Wnt signaling pathway plays a decisive role in morphological development and oriented differentiation of hair follicle stem cells(HFSCs)with the ability of self-replication and the potential of multiplex differentiation.Investigation of many important proteins involving in Wnt signaling pathway such as Wnt,Frizzled,β-catenin,GSK3β,APC,Axin has been carried out relatively earlier and deeper.While investigation of some downstream effectors especially the transcription factors located in cell nucleus,like Tcf3,Lef1 and gene c-myc,cyclinD1 regulated by Tcf3 and Lef1 is still at the primary phase. This paper reviews gene regulation of oriented differentiation of hair follicle stem cells by Wnt signaling pathway,so as to provide theoretical reference in tissue engineered skin.