胡艳娟 陈 峰, 李 莉 梁国雄 张守全 (华南农业大学动物科学学院 广州 5064广东省温氏食品集团 广东新兴 57439)

几种处理方法对鸡精液冷冻保存效果的影响*

胡艳娟1陈 峰1,2李 莉1梁国雄2张守全1(1华南农业大学动物科学学院 广州 5106422广东省温氏食品集团 广东新兴 527439)

本文从冷冻保存主要环节的几种处理方法对鸡精液冷冻保存的效果进行了探讨，结果显示：采用液氮熏蒸法的冻后活力和复苏率均显著高于直接投入液氮法；采用细管冷冻的冻后活力和复苏率均显著高于颗粒冷冻；采用两步稀释法的冻后活力和复苏率均显著高于一步稀释；精液平衡0.5h、1h、2h精子冻后活力和复苏率均差异不显著；熏蒸时间为10min的冻后活力和复苏率均显著高于5min，且略高于15min但差异不显著；37～40℃解冻后精子活力和复苏率显著高于20～25℃，但与55～60℃差异不显著。

鸡精液 冷冻保存 精子活力 复苏率

鸡精液冷冻技术对于最大限度地利用遗传性能优秀的种公鸡，有效地保护许多濒临灭绝的地方品种，保持鸡遗传资源的多样性等有着重要的意义。但是鸡精液冷冻技术尚处于实验阶段，各种冷冻方法都有待于进一步提高。本实验希望探索出一套优良的冷冻保存工艺，以优化鸡精液冷冻保存程序，提高冷冻保存后精子活力和复苏率。

1 材料与方法

1.1 试验材料：本试验公鸡精液采自广东省广州市华南农业大学种鸡场的粤黄鸡。

1.2 稀释液配方：5%葡萄糖液为基础液，添加13%甘油和15%新鲜卵黄为冷冻保存终溶液。

1.3 精液稀释与平衡：比较2种方法，（1）一步稀释：直接用含冷冻保护剂的冷冻终溶液1∶1稀释，置于4℃冰箱，平衡待用。（2）两步稀释：第一步先用不含冷冻保护剂的基础液1∶1稀释，然后置于4℃冰箱1h；第二步再以1∶1比例将含冷冻保护剂的冷冻保存终溶液（先前已置于4℃冰箱预冷）加入到第一步已稀释的精液中，轻轻混匀后置于4℃冰箱平衡待用。

1.4 精液的冷冻：比较颗粒冷冻法与细管冷冻法。

颗粒冷冻方法如下：（1）液氮熏蒸法：将保温瓶里装2/3的液氮，在液氮面上放置一铝盒预冷，然后用吸管取平衡好的稀释精液滴在铝盒上熏蒸（每个颗粒剂量0.2mL），熏蒸完后将颗粒浸入液氮保存。（2）直接投入液氮法：将保温瓶里装2/3的液氮，然后直接用吸管取平衡好的稀释精液滴在液氮里冷冻。

细管冷冻方法如下：将平衡后的精液取出，用吸管将精液吸入0.25mL的牛用冻精细管里，封口。将保温瓶里装2/3的液氮，在液氮面上方2～3cm处架上一层塑料管支撑的网，然后将做好的细管水平放在塑料网上熏蒸，熏蒸完后浸入液氮保存。

2 结果与分析

2.1 冷冻速度对冻精活力的影响：

表1 颗粒冷冻不同滴冻方法的比较

由表1可以得出：采用液氮熏蒸法的冻后活力和复苏率均显著高于直接投入液氮法，说明太快的冷冻速度不利于精子的保存。

2.2颗粒冷冻与细管冷冻对冻精活力的影响：由表2可以看出，采用细管冷冻的冻后活力和复苏率均显著高于颗粒冷冻，表明采用细管冷冻法的效果明显优于颗粒冷冻法。

2.3 稀释方法对冻精活力的影响：由表3可以看出，采用两步稀释法的冻后活力和复苏率均显著高于一步稀释，表明采用两步稀释法的效果明显优于一步稀释法。

2.4 平衡时间对冻精活力的影响：由表4可以看出，平衡0.5h、1h和2h的冻后活力及复苏率均差异不显著，表明不同平衡时间对冷冻效果影响不大。

2.5 熏蒸时间对冻精活力的影响：由表5可以看出，熏蒸时间为10min的冻后活力和复苏率均显著高于5min，且略高于15min试验组，但差异不显著；5min试验组与15min试验组之间差异不显著，表明熏蒸时间采用10min的效果好。

2.6 解冻温度对冻精活力的影响：由表6可以看出，解冻温度为37～40℃的冻后活力和复苏率均显著高于20～25℃，且略高于55～60℃，但差异不显著，20～25℃与55～60℃之间差异不显著，表明解冻温度采用37～40℃最好。

3 讨论

3.1 关于冻精类型的选择：目前冻精的类型主要有颗粒型冻精与细管型冻精。对于牛、羊等射精量较小的家畜冷冻精液，目前普遍使用0.25mL的微型细管。因为0.25mL的微型细管直径小、管壁薄，在冷冻制作过程中受冻均匀，活力提高，促进受胎率提高（吴结革等，2003）。但是微型细管容量小、装精液少，不适合用于马、猪等输精量较大的家畜。而颗粒冻精单个颗粒内有效精子数少，但它具有体积小，能充分利用冷冻贮存设备，冷冻方便，精液利用率高等优点。若要克服其有效精子数不足的弱点，只要增加每次输精的颗粒数即可。参考以上资料，本实验选取了0.25mL的细管冻精和0.2mL的颗粒冻精进行比较，结果显示同种稀释液细管冻精的冻后活率和复苏率显著高于颗粒冻精。可能是因为0.25mL的微型细管管壁薄且直径小，在冷冻制作过程中受冻均匀，能较好地保护精子免受损害，提高精子活力。虽然微型细管容量小，但由于鸡输精量少，所以鸡精液用细管冻存应该还是有较强适用性的。

表2 颗粒冷冻与细管冷冻的比较

表3 不同稀释方法对冷冻精液活力的影响

表4 平衡时间对冷冻精液活力的影响

表5 熏蒸时间对冷冻精液活力的影响

表6 解冻温度对冷冻精液活力的影响

3.2 关于冷冻速度的控制：冷冻过程中的精子细胞不但要对保存温度（-196℃）有耐受能力，而且要能经受从射精时机体温度到保存时超低温度的变化而活力不会过度降低，后者比前者更显得重要（马金霞等，2004）。而过快的降温速度会使得结晶速度超过细胞内水分逸出的速度，导致细胞在脱水前，其体内已经结冰，从而造成细胞内冰晶的机械损伤。基于此，本实验进行了液氮熏蒸法和直接投入液氮法的比较，结果显示，采用液氮熏蒸法的精子活力和复苏率明显高于直接投入液氮法。原因就是液氮熏蒸法使得精子由机体的较高温度降低到超低温度的过程不会太快，增强了精子对温度变化的耐受能力；而直接投入液氮法因为降温速度太快导致了精子内部形成冰晶而损伤，从而降低了活力。另外，关于熏蒸时间的长短，本实验中，熏蒸时间为10min的效果最佳，优于5min和15min，表明熏蒸时间要适中，不宜太短和太长。

3.3 关于精液的稀释方法：本实验进行了一步稀释法和两步稀释法保存效果的比较，结果显示：两步稀释法的效果明显优于一步稀释法。主要原因就是：根据研究报道，在常温下，甘油会损伤精子顶体和颈部，造成尾部弯曲，破坏某些酶类，从而影响受精率（刘建忠等，2005；王洪亮等，2005）。Ogasawara等（1997）报道在冻前向鲜精加甘油稀释液，会使细胞膜松弛，并产生线粒体膨胀。另有研究表明，在3～5℃时添加甘油可以保持更高的解冻后活力（Mathur et al，1989），所以通常在降温到3～5℃时使用甘油。而两步稀释法就是因为先用不含保护剂的稀释液稀释精液并慢慢降温至4℃，然后再加入4℃预冷的保护剂进行平衡。这样就可以避免甘油直接作用于鲜精，减少常温下甘油对精子作用的时间从而降低甘油对精子的损害。

3.4 关于冷冻前的平衡时间：精液经稀释后要有一个缓慢降温的过程，特别是降到22℃以下时，精子低温打击比22℃以上时更为敏感。添加保护剂后的稀释精液，要置于4℃经过一定时间的放置，这个放置时间就是平衡时间。平衡是为了使甘油等冷冻保护剂渗入精子体内，产生抗冻保护作用。由于稀释液、防冻剂以及试验方法等各不相同，冷冻前的平衡时间也不一致。Mitchell等（1948）比较了以DMSO作冷冻保护剂时不同平衡时间（15～105min）对冷冻效果的影响，结果表明DMSO不同的平衡时间的冷冻效果没有差异；而Sexton（1977）的研究表明，加DMSO后平衡2h的效果明显优于不平衡（0h）和平衡时间过长（4h、6h）的效果。本实验比较了平衡0.5h、1h和2h后冷冻保存的效果，结果显示，这3个平衡时间冻后精子活力和复苏率差异均不显著，表明平衡时间的长短对冷冻保存效果没有明显影响。

3.5 关于冻精解冻温度的选择：无论是冷冻还是解冻都要求在较短时间内越过危险温区（0～60℃），避免低温对精细胞的损伤。本试验结果显示，细管冻精在37～40℃水浴中解冻效果明显优于20～25℃水浴中解冻，但与55～60℃水浴中解冻效果差异不显著。这可能是由于20～25℃解冻，冷冻精液升温较慢，精子不能安全通过危险温区，造成损伤比较大，这表明在防止冰晶形成过程中，较高温度和较快的解冻速率对精子损伤小，有利于解冻后鸡精子的存活。虽然55～60℃解冻效果与37～40℃差异不显著，但由于55～60℃温度较高，不易控制，所以认为解冻温度以37～40℃为宜。

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S831.4

A

1008-3847(2011)06-0006-03

*本项目由广东温氏食品集团提供资助

张守全，sqzhang@scau.edu.cn

罗庆斌