杨晓丹，李巨

（1.辽宁医学院附属第一医院妇产科，辽宁 锦州 121001；2.沈阳军区第202医院妇产科，沈阳 130001）

SELDI筛选绒癌耐氨甲喋呤细胞株耐药相关蛋白

杨晓丹1，李巨2

（1.辽宁医学院附属第一医院妇产科，辽宁 锦州 121001；2.沈阳军区第202医院妇产科，沈阳 130001）

目的应用飞行时间质谱技术结合蛋白芯片分析筛选人绒毛癌细胞株JAR及其与人绒毛癌耐氨甲喋呤细胞株JAR/MTX之间的蛋白质表达差异，寻找出绒癌耐药的相关蛋白。方法 采用体外细胞培养来提取两种细胞的胞浆蛋白和分泌蛋白，应用SELDI-TOF-MS技术检测各细胞株提取的胞浆蛋白和分泌蛋白，采用CM-10型弱阳离子交换芯片检测。结果 经SELDI技术检测发现质荷比（m/z）为8132.043，10738.36的胞浆蛋白在JAR/MTX细胞中呈高表达；质荷比（m/z）为11555.09的分泌蛋白及m/z为4896.68的胞浆蛋白在JAR细胞中高表达，在JAR/MTX中呈低表达。结论应用飞行时间质谱技术结合弱阳离子交换芯片，可有效筛选绒癌耐氨甲喋呤细胞株中的特异性表达蛋白；寻找到的差异蛋白与绒癌耐药密切相关，并可能成为本病耐药的标志物。

滋养细胞肿瘤；JAR细胞株；JAR/MTX细胞株；蛋白芯片；差异蛋白；飞行时间质谱；表面增强激光解吸离子化

妊娠滋养细胞肿瘤（gestational trophoblastic tumour，GTT）是一组来源于胎盘滋养细胞的肿瘤，它类似于肿瘤细胞，有增殖、分化、侵袭的特点。由于其独特的组织学来源和生物学行为以及对化疗的敏感性，绒癌已成为最早可以治愈的实体肿瘤。然而对于耐药患者的治疗效果却难以令人满意而成为治疗的难题，从而需要不断探索本病出现耐药的机理及新的治疗方法以解决这类病人的耐药问题。

目前临床上关于肿瘤耐药的检查手段具有自限性和滞后性，蛋白质组学［1］高灵敏度和特异性的分析技术有助于捕获肿瘤演变过程中细微的分子变化，使之成为诊断和监测肿瘤演进的重要线索，特别是差异蛋白组织学问世，人们应用SELD-TOF-MS技术表面加强的激光解析/电离化时间—飞行质谱仪结合配套的蛋白质芯片技术［2］，已经筛选出了乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等十余种肿瘤的血清特异性蛋白质。本研究通过检测人绒癌细胞株JAR和耐药细胞株JAR/MTX两种细胞株的蛋白质指纹图谱，以寻找与人绒癌耐药密切相关的蛋白，进一步探讨绒癌耐药的原因，并为深入研究绒癌耐药的标志物提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人绒毛膜癌耐氨甲喋呤细胞株JAR/MTX购于浙江医科大学附属妇产科医院；人绒毛膜癌细胞株JAR购于美国ATCC公司。

1.1.2 主要试剂及仪器：胎牛血清，RPMI-1640培养液购于美国HyCLone公司，U9（9mol/L Urea，2%CHAPS），乙晴，三氟乙酸，白芥子酸（SPA），尿素，4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），HPLC水等均购于美国Sigma公司的色谱级产品，蛋白提取试剂盒及BCA蛋白含量检测试剂盒购于南京凯基生物公司，蛋白质芯片时间质谱飞行仪（PBSIIC）及其CM-10型弱阳离子交换芯片购于美国Ciphergen公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养复苏液氮冻存JAR及JAR/MTX细胞株，常规培养含10%的胎牛血清、RPMI1640培养液中，置37℃、5%CO2培养箱饱和湿度下传代培养。

1.2.2 细胞分泌蛋白的提取：待两种细胞生长率为90%左右，PBS冲洗细胞3次，更换不含胎牛血清的RPMI-1640培养基继续培养24h。离心管收集同种细胞培养基，超滤离心浓缩，置于-80℃保存。

1.2.3 细胞胞浆蛋白的提取：按10～14μl/cm2加入细胞裂解液，冰上孵育30min，收集同种细胞裂解液，10000r/min低温离心30min，取上清分装，置于-80℃保存。

1.2.4 CM-10型蛋白芯片操作步骤：样品冰上融解后，10000r/min，4℃，离心2min。取96孔板细胞培养板，放冰盒上；取出芯片，装入生物芯片处理器，在芯片上加 10μl U9，每孔分别再加 5μl样品，600r/min4℃，振荡 30min；加 200μl 50mmol/L pH 4.0NaAC，用力拍干。加 200μl NaAC 600r/min 5min 3次（常温）。每孔加入200μl HPLC水，迅速甩干。待芯片表面自然晾干后，各点加SPA0.5μL，重复一次后用蛋白芯片阅读机进行蛋白质谱的检测分析。

1.2.5 数据采集和结果分析：采用CM-10型蛋白芯片机进行检测筛选，并用PBSIIC型蛋白芯片阅读机读取芯片的信息，仪器参数设置为：初始激光强度190，检测敏感度 7，质荷比（m/z）为 Mr2000～20000的蛋白峰。由于受金属离子及基质的影响本研究将m/z小于2500的基质峰排除。采用美国Ciphergen Protein Software 3.2.0版本的分析软件生成的数据，然后用 Biommarker Wizard软件分析 JAR，JAR/MTX，两组间峰值差异P值。

2 结果

2.1 人绒毛膜癌细胞株（JAR）与人绒毛膜癌耐氨甲喋呤细胞株（JAR/MTX）之间分泌蛋白的差异性表达

应用CM-10型蛋白芯片检测人绒毛膜癌细胞株（JAR）与人绒毛膜癌耐氨甲喋呤细胞株（JAR/MTX）所提取的分泌蛋白，并采用Biommarker Wizard软件分析后显示，两组间的蛋白图谱存在差异蛋白峰，其m/z为11555的蛋白在JAR中呈高表达，在 JAR/MTX 中呈低表达（P＜0.05）（图 1）。

2.2 人绒毛膜癌细胞株（JAR）与人绒毛膜癌耐氨甲喋呤细胞株（JAR/MTX）之间胞浆蛋白的差异性

应用CM-10型蛋白芯片检测人绒毛膜癌细胞株（JAR）与人绒毛膜癌耐氨甲喋呤细胞株（JAR/MTX）所提取的胞浆蛋白，采用Biommarker Wizard软件分析后显示，两组间的蛋白图谱存在3个差异蛋白峰，m/z分别为8132，10738在JAR/MTX中呈高表达，4896在JAR中高表达（P＜0.05）（图2）。

3 讨论

研究表明，肿瘤的发生早期就可在蛋白水平发生结构上重要的改变，肿瘤的发生发展过程中，有许多不同功能性的蛋白参与其中，蛋白表达异常不仅包括了蛋白量表达的增多或减少，还有蛋白加工翻译后的改变，这些都可能影响到肿瘤的发展过程及生物学行为。SELDI-TOF-MS根据蛋白质芯片表面不同的修饰M特性，选择性地捕获样品中与之特异性结合的蛋白，具有简单、快速、敏感、高通量、粗样本和上样量少的特点［2］。本实验利用此技术检测了绒癌细胞株JAR与绒癌耐氨甲喋呤细胞株JAR/MTX的蛋白质图谱，CM-10型芯片利用它弱阳离子的特性，其表面有弱阴离子羧基，可以与被分析物表面的正电荷集团相互作用而捕获正电荷蛋白［3］。为了保证实验结果的可靠性，每种细胞收获3次，以排出组间差别；每份样品在同种芯片3个以上不同点进行检测，以排除不同芯片间点之间的差异。通过比较蛋白质谱发现，在两种细胞株中有4个蛋白质峰有明显变化。

从以上实验结果可以看出，在提取的胞浆蛋白中人绒癌耐氨甲喋呤JAR/MTX的细胞株中Mr 8132，10738蛋白表达明显升高，而4896在JAR细胞中呈高表达。表明JAR/MTX细胞株出现耐药可能与8132，10738蛋白的升高有关。当然，上述筛选出的差异蛋白还需要从相应的血清和组织标本中进一步证实和鉴定。

体外培养的细胞株虽然不能完全反应体内细胞的生长状态和生物学活性，但它具有成分单一、均质性好、实验条件容易控制等优点。尤其在做对比性研究时可避免有组织细胞成分复杂，细胞异质性高等缺点造成的结果不真实和不可靠［4］。我们培养了JAR，JAR/MTX细胞，裂解细胞蛋白后，SELDI-TOFMS分析蛋白表达的差异。绒癌在发生，发展过程中其细胞内的蛋白质变化可以反映到血清中，可从体外培养的绒癌细胞株中筛选出部分与癌症病人血清中相一致的标志蛋白，这部分蛋白可能就是与耐药的发生密切相关的功能蛋白或调节蛋白。

蛋白质芯片技术目前已广泛用于临床各种疾病的研究中，已经筛选出了乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等十余种肿瘤的血清特异性蛋白质［5］，目前对绒癌耐药方面相关研究甚少，而关于本病耐药特异蛋白的研究除本课题组的报告外未见其他报道。由于该技术的应用成本相对较高，对技术的掌握和熟练程度还需提高。小分子量蛋白质的检测仍然没有像大分子量蛋白质检测那么容易，质谱检测出的蛋白质不能直接鉴定，必须通过后续的检测方法判断蛋白质的种类，这些都限制了该技术在临床领域大规模的运用［6］。

［1］Lim JY，Cho JY，Paik YH，et al.Diagnost-ic application of serum proteomic patterns in gastric cancer patients by proteinchip surfaceenhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry［J］.Int J Biol Markers，2007，22（4）：281-286.

［2］MerchantM，Weinberger SR.Recent advancements in surface enhanced laser desorp tion/ionization time of flight mass spectrometry［J］.Ctrophoresis，2000，21（6）：1164-1771.

［3］Xu WH，Chen YD，Hu Y，et al.Preoperatively molecular staging with CM10ProteinChip and SELDI-TOF-MS for colorectal cancer patients［J］.Zhejiang Univ Sci B，2006，7（3）：235-240.

［4］夏梁，蔡伟丽，张丽丽，等.体外培养的不同亚型肺癌细胞株差异蛋白的初步分析［J］.现代仪器，2004，1：13-17.

［5］Issaq HJ，Conrads TP，Prieto DA，et al.SELDITOF MS for diagnostic proteomics［J］.Anal Chem，2003，75（7）：148A-155A.

［6］KasK.Onthetechnicalitiesofdiscoveringandapplyingproteinbiomarkers for cancer prevention［J］.Eur J Cancer Prevention，2004，13（5）：437-446.

（编辑孙宪民，英文编辑郑华川）

Screening Resistance-related Protein in JAR/MTX Cell Line by SELDI

YANG Xiao-dan1，LI Ju2
（1.Department of Obsterics and Gynecology，The First Affiliated Hoppital of Liaoning Medical College，Jinzhou 121001，China；2.Department of Obsterics and Gynecology，No.202Hospital of the Chinese People′s Liberation Army，Shenyang 110003，China）

ObjectiveThis study aimed to analyze the differences between the human placenta cancer cell line JAR and the methotrexateresistant JAR/MTX and screen out the drug resistance-associated proteins in the choriocarcinoma.MethodsThe protein was extracted from culture cell and to examine the cytoplasmic and secreted proteins using the surface-enhanced laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry（SELDI-TOF-MS）.This cell lines were tested using CM-10weak cation exchanging protein chip.ResultsThe cytosolic proteins with mass charge ratio（m/z）of 8132.043，10738.36in the cytoplasmic protein was highly expressed in JAR/MTX cells.The secreted protein with mass charge ratio （m/z）of 11555.09and the cytolosic protein with the mass charge ratio（m/z）of the 4896.68was highly expressed in JAR cells，but lowly in JAR/MTX cells.ConclusionThe combination of the time of flight mass spectrometry technology with a weak cation exchanging protein chip might effectively screen specific proteins of MTX-resistant choriocarcinoma cell line and explore the relation between protein expression and drug resistance in the choriocarcinoma.

gestational trophoblastic tumour；protein chip；differentially expressed protein；time of flight-mass spectrometry；surface-enhanced laser desorption and ionization

R73-35+1；R730.231

A

0258-4646（2011）01-0045-03

杨晓丹（1983-），女，硕士.

李巨，E-mail：lxz3110@163.com

2010-04-01