刘春来，刘嘉，刘屹立，王平

（中国医科大学附属第四医院泌尿外科，沈阳 110032）

热疗对膀胱癌细胞耐药性的影响

刘春来，刘嘉，刘屹立，王平

（中国医科大学附属第四医院泌尿外科，沈阳 110032）

目的探讨热疗对膀胱癌细胞耐药性的影响。方法 不同温度条件下热疗与化疗联合作用耐药膀胱癌细胞株BIU-87后，用MTT法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡和survivin表达的变化。结果 热疗可显著增强羟基喜树碱对BIU-87的抑制作用，并可减少survivin的表达。热疗可以诱导BIU-87的凋亡，并呈温度依赖性。结论热疗可增强化疗药物作用，部分逆转膀胱癌细胞的耐药性，并促进凋亡。

膀胱移行细胞癌；BIU-87细胞株；热疗；凋亡；生存素

膀胱肿瘤多药耐药性的存在常导致临床膀胱灌注化疗失败。临床报道热疗可逆转膀胱移行细胞癌的耐药性，但其机制尚不清楚。本研究拟在体外培养条件下，对热疗逆转耐药膀胱癌细胞株的多药耐药性的可行性及效果进行判定，探讨热疗在膀胱癌耐药性逆转发生过程中的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

对羟基喜树碱耐药的膀胱癌细胞株BIU-87，由北京大学泌尿外科研究所提供。羟基喜树碱、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、碘化丙锭、小鼠抗人survivin单抗及小鼠抗人同型对照IgG、羊抗小鼠IgG-FITC、AnnexinⅤ-FITC试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：BIU-87细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养，培养液RPMI 1640含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素。细胞为上皮样贴壁生长，每2～3d传代1次。取生长期细胞接种于培养瓶中，24～48h后待细胞处于指数生长期，取出细胞用于实验。

1.2.2 MTT法：细胞浓度为 2.5×104/ml，每孔加 100μl接种于3块96孔板，待6h细胞贴壁后，试验组加羟基喜树碱至终浓度为0.01mg/ml，置于37℃、39℃、41℃、43℃，对照组加PBS，作用2h后去除含药培养液。培养24、48和72h后，每孔加MTT（5mg/ml，美国 Sigma 公司）20μl孵育 4h，弃上清，加入DMSO 150μl，酶标仪570nm处测吸光度A值。设3个复孔取均值，试验重复3次，按下列公式计算细胞抑制率：细胞抑制率（%）=（1-实验组A值/对照组A值）×100。

1.2.3 流式细胞术检测survivin的表达：BIU-87细胞5瓶，试验组加羟基喜树碱至终浓度为0.01mg/ml，置于 37℃、39℃、41℃、43℃，对照组加 PBS作用2h后去除含药培养液，培养72h后，4%多聚甲醛4℃固定20min，PBS洗涤，加入含0.25%Triton X2100的PBS室温破膜10min，PBS洗涤，分别加入100μl小鼠抗人survivin单抗及小鼠抗人同型对照IgG（1∶100稀释），室温孵育 30min，再加入100μl FITC标记的羊抗小鼠 IgG（1∶100稀释），4℃避光孵育20min，调整细胞浓度为1×106/ml。流式细胞术检测以同型对照管设置阳性界值，survivin抗原表达水平以平均荧光强度表示，试验重复3次。

1.2.4 流式细胞术检测细胞周期及凋亡：BIU-87细胞5瓶，试验组加羟基喜树碱至终浓度为0.01mg/ml置于37℃、39℃、41℃、43℃，对照组加PBS作用2h后去除含药培养液，培养72h后，70%乙醇固定细胞，加入碘化丙锭和AnnexinⅤ-FITC 4℃避光染色30min，放入流式细胞仪的样品室，进行检测，试验重复3次。

1.3 统计学分析

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各标本均计数1×104个细胞，所有资料经Cell Quest软件收集分析。采用SPSS 10.0软件，方差分析检验各组间的差异，两两比较采用SNK法，Dunnettt检验分析各试验组与对照组间的差异。P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结果

2.1 热疗对BIU-87细胞生长的影响

热疗使细胞生长受到抑制，单纯热疗组不同温度组间细胞抑制率的差异有统计学意义（P＜0.05），其抑制程度具有温度依赖性；单纯热疗组与热疗联合化疗组比较有统计学差异（P＜0.05），热疗明显增加化疗的作用。见表1。

2.2 热疗对BIU-87细胞凋亡及周期的影响

单纯热疗组中凋亡细胞百分比及SubG0/G1期细胞百分比39℃、41℃、43℃与37℃比较明显增多（P＜0.05），作用呈温度依赖性。DNA含量分析显示单纯热疗组G2/M期细胞所占比例39℃、41℃、43℃与37℃比较明显减小（P＜0.05）。单纯热疗与热疗联合化疗组比较，凋亡细胞百分比及Sub G0/G1期细胞百分比有统计学差异，热疗明显增加化疗的作用。见表2。

表2热疗和热疗联合化疗对B I U-87细胞作用72h后细胞周期及凋亡变化的影响（%）T a b.2C e l l c y c l e c h a n g e s a f t e r 72h o u r s t r e a t e d b y h y p e r t h e r mi a a n d c h e mo t h e r a p y（%）G0/G1 S G2/M SubG0/G1 Apoptosis Control Chemotherapy ControlChemotherapy Control Chemotherapy Control Chemotherapy ControlChemotherapy 37℃ 73.21 74.33 15.54 17.82 5.62 2.43 5.63 5.42 4.76 4.8239℃ 81.93 82.12 9.41 8.65 1.021） 0 7.641） 9.232） 6.131） 8.402）41℃ 85.89 83.68 4.79 2.68 01） 0 9.321） 13.642） 8.791） 12.962）43℃ 86.58 81.43 1.12 0.55 01） 0 12.301） 18.022） 11.071） 16.452）1）P＜0.05vs 37℃；2）P＜0.05vs control group.Temperature

2.3 热疗对BIU-87细胞survivin表达的影响

经37℃、39℃、41℃、43℃作用后，BIU-87细胞survivin表达减少，单纯热疗组不同温度间有统计学差异（P＜0.05），呈温度依赖性减少。见表3。

3 讨论

近年来热疗因其安全有效且不良反应低已越来越多地应用于恶性肿瘤综合治疗中。热疗能选择性地杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞没有影响。温度在40℃～43℃之间，对肿瘤细胞发挥最大效应，温度低于40℃，对肿瘤细胞影响作用小，大于43℃～45℃，肿瘤细胞主要表现为坏死［1］。本研究热疗温度选择在37℃～43℃，建立不同作用时间、不同温度下热疗对BIU-87细胞细胞株作用的生长抑制曲线，发现热疗对BIU-87细胞生长有明显的抑制作用，并且抑制作用呈温度依赖性。应用流式细胞仪检测热疗对BIU-87细胞细胞周期及凋亡，提示热疗促进BIU-87细胞细胞的凋亡，其促进凋亡的作用呈温度依赖性。

表3热疗和热疗联合化疗对B I U-87细胞作用72h后s u r v i v i n表达的影响（±s，%）T a b.3S u r v i v i ne x p r e s s i o na f t e r 72h o u r st r e a t e db yh y p e r t h e rmi a a n d c h e mo t h e r a p y（±s，%）Survivin Control Chemotherapy 37℃ 5.60±2.24 4.60±1.8339℃ 3.20±1.361） 2.20±0.9541℃ 0.70±0.211） 0.52±0.1843℃ 0.20±0.061） 0.13±0.041）P＜0.05vs 37℃.Temperature

膀胱移行癌是泌尿系统最为常见的恶性肿瘤之一，其中75%～85%为浅表性膀胱癌，经尿道膀胱肿瘤电切术后行膀胱灌注化疗5年内复发率高达24%～84%。其高表达多药耐药基因是膀胱肿瘤耐药的主要原因，机制之一是耐药基因在不同组织中表达差异性有关，与P糖蛋白、多药耐药相关蛋白、肺耐药相关蛋白、谷胱甘肽或谷胱甘肽S转移酶过度表达、拓扑异构酶Ⅱ活性降低或含量减少、DNA损伤修复能力加强、ras基因的活化和Bcl-2的高表达等也关系密切。多项研究表明热疗联合化疗可以提高肿瘤治疗的疗效［2］，膀胱热灌注化疗是治疗非肌层浸润性膀胱癌的一种重要方法，可以明显降低复发率。本研究通过不同作用时间、不同温度下羟基喜树碱对BIU-87细胞作用，发现热疗对化疗有明显增强作用，促进BIU-87细胞细胞的凋亡，其作用呈温度依赖性。

热疗已成为人们关注的逆转肿瘤多药耐药的热点之一。本研究发现热疗可部分逆转BIU-87细胞的耐药性。Leng等［3］报道热疗可以逆转舌鳞癌细胞Tca8113/CBDEA 的耐药性。Agostineli等［4］研究也得到相同结果。有文献报道［5，6］热疗合并药物膀胱灌注治疗浅表性膀胱癌的疗效，丝裂霉素C 20mg溶于50ml蒸馏水经尿道注入膀胱内，灌药后立即进行915MHz微波偶极子辐射透热膀胱区，膀胱内温度透热41℃～44℃，每次1h。1年后随访，复发率为14.3%，2年后随访复发率为24.6%。患者膀胱镜检查分化程度及级别没有进展。与单纯化疗药物和（或）卡介苗膀胱灌注相比，热化疗治疗膀胱癌是安全有效的方法，特别对于曾卡介苗膀胱灌注失败的患者。

热疗逆转多药耐药的机制复杂，热疗可以促进化疗药物诱发细胞凋亡的过程，诱导凋亡相关基因的表达发生改变［7］，与肿瘤热疗相关的凋亡基因有p53、Fas、Bcl-2、c-myc、c-fos等，已有研究证实靶向survivin的siRNA能抑制肿瘤细胞的增殖，可以增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，促进其凋亡。survivin是凋亡抑制蛋白家族重要成员之一，是迄今发现的作用最强的细胞凋亡抑制因子，不仅抑制细胞凋亡，还参与了细胞周期的调控和新生血管的生成。研究表明［8］，survivin高表达于膀胱肿瘤中，是导致膀胱癌复发的可能性因素。耐药肺癌细胞株中survivin表达较非耐药者高，survivin过度表达可能会帮助肿瘤细胞克服G2/M期的凋亡检测点并且促进变形细胞通过有丝分裂的变异进程［9］。survivin参与肿瘤细胞的耐药，肿瘤细胞内这些抑制蛋白水平升高是肿瘤细胞逃避抗癌药物杀伤作用的原因之一［10］。Liu等［11］使用 siRNA 技术敲除胰腺癌细胞中的survivin后发现明显增强吉西他滨的敏感性。Wang等［12］应用2种survivin siRNA靶向治疗骨肉瘤细胞MG-63可以显著促进细胞凋亡，并且增加阿霉素及顺铂的药物敏感性。本研究结果表明，BIU-87细胞中survivin的表达随温度的增高而逐渐降低，据此可推测，热疗通过降低survivin表达增强了BIU-87细胞对羟基喜树碱的敏感性，部分逆转其耐药性，最终诱导BIU-87细胞的凋亡。但热疗通过何种途径导致肿瘤细胞凋亡和逆转其耐药性增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性还需要深入探讨。

本研究结果初步表明，热疗对人膀胱癌细胞株BIU-87有抑制其生长、增殖和诱导凋亡的作用，可部分逆转肿瘤细胞耐药且呈现温度依赖性。热化疗不良反应小，可应用于膀胱灌注治疗和辅助治疗膀胱癌，特别对于治疗卡介苗膀胱灌注失败的患者是安全有效的治疗方法。

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（编辑陈 姜，英文编辑郑华川）

The Effect of Hyperthermia on Multidrug Resistance in Bladder Cancer Cells

LIU Chun-lai，LIU Jia，LIU Yi-li，WANG Ping
（Department of Urology，The Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110032，China）

ObjectiveTo investigate the effect of hyperthermia on multidrug resistance in BIU-87cell line.MethodsBIU-87cells were treated by hydroxycamptothecin at different temperature （37℃～43℃），and then subjected to the proliferation assay by MTT.The expression of survivin，cell cycle and apoptosis were determined by flow cytometry.ResultsHyperthermia enhanced the inhibitory effects of hydroxycamptothecin on BIU-87cells and reduced the expression of survivin.Hyperthemia could induce the apoptosis of BIU-87cell in temperaturedependant manner.ConclusionHyperthermia can enhance the inhibition rate of chemotherapeutics drugs，partially reverse the multidrug resistance and induce the apoptosis of BIU-87cells.

bladder transitional cell carcinoma；BIU-87cell line；hyperthermia；apoptosis；survivin

R737.14

A

0258-4646（2011）01-0023-04

辽宁省博士启动基金资助项目（20101139）

刘春来（1974-），男，主治医师，博士.E-mail：lcllmh@126.com

2010-07-16