奚琦，刘学敏，杜鹃

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳 110004）

缺氧诱导因子1α在宫内缺氧缺血性脑损伤的胎鼠脑组织中的表达

奚琦，刘学敏，杜鹃

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳 110004）

目的探讨宫内缺氧缺血性脑损伤后不同复氧时间胎鼠脑组织中缺氧诱导因子1α（HIF-1α）蛋白的表达规律。方法孕19d Wistar大鼠36只，随机分为对照组和8个实验组，每组4只。实验组建立宫内缺氧缺血性脑损伤动物模型后，分别于子宫恢复血供后0、0.5、2、4、8、12、24及48h取胎鼠脑组织；对照组只暴露双侧子宫15min后，取胎鼠脑组织，应用免疫组织化学方法检测HIF-1α蛋白的表达。结果 实验组缺氧诱导因子1α蛋白表达在术后8h明显升高，12h达到高峰，24h后明显下降。结论HIF-1α在宫内缺氧缺血性脑损伤的胎鼠脑组织中的表达随着复氧时间的延长呈现先升高后降低的趋势。

缺氧诱导因子1α；缺氧缺血性脑损伤；胎鼠；脑组织

新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是围产期缺氧导致的脑细胞损伤，是造成儿童智力障碍及残疾的最常见原因。由于中枢神经系统极度依赖有氧氧化提供能量，故神经系统对低氧最敏感。新生儿HIE可发生在产前、产时及产后3个时期，因此将宫内缺氧作为HIE的重要原因之一。

缺氧诱导因子 1α（hypoxia-inducible factor 1alpha，HIF-1α）是缺氧条件下产生的具有转录活性的核蛋白，通过转录及转录后调控使机体和组织产生对缺氧的适应反应，是近年来较受重视的脑保护因子之一。目前多数有关缺氧缺血性脑损伤治疗的研究也是通过提高HIF-1α的表达来实现的。本研究旨在通过动物模型，探讨宫内缺氧缺血性脑损伤后随着复氧时间的延长，胎鼠脑组织中HIF-1α蛋白的表达规律，为治疗宫内缺氧缺血性脑损伤的时限研究提供有力的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：由中国医科大学附属盛京医院实验动物室提供的健康SPF级成年雌性Wistar大鼠［合格证号：SYXK（辽 2003-0019）］36只，体质量 250～280g，均为处女鼠，选择9只SPF级成年雄性Wistar大鼠（合格证号同前），体质量300～350g，与雌鼠分批分次以1∶1合笼过夜，第2日晨取出雄鼠，于雌鼠行阴道涂片，以显微镜下见到精子为交配成功。按照交配成功的先后顺序分为1个对照组和8个实验组，每组各4只，其中实验组分别为复氧 0、0.5、2、4、8、12、24、48h组。以合笼第2日记为妊娠0d，此后孕鼠分笼饲养。

1.1.2 主要试剂及仪器：UltraSensitiveTMS-P试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司），DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司），HIF-1α小鼠单克隆抗体（Santa Cruz公司，德国）。恒温培养箱（广州永程实验仪器有限公司，DNP-9162型），图像采集系统Nikon ECLIPSS E800（日本）、显微镜Olympus CX41（日本），ImagePro Plus图像分析软件（美国）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备：参照杜鹃等［1］方法制备缺血缺氧胎鼠模型。于妊娠19d实施手术。步骤：（1）术前测量体质量；（2）给予10%水合氯醛腹腔注射，剂量为3.5×10-3ml/g；（3）孕鼠取仰卧位固定四肢，备皮后术野消毒，铺无菌巾，取腹部纵行切口，长约5cm，依次切开腹壁各层进入腹腔，探查并暴露双侧子宫，用微小动脉夹夹闭双侧子宫的子宫动静脉和卵巢动静脉15min，而后恢复血供，将子宫还纳入腹腔，用0号丝线缝合腹壁各层。

1.2.2 胎鼠脑组织的收集：实验组的8个组，分别于还纳子宫后 0、0.5、2、4、8、12、24及 48h 后取出胎鼠，麻醉，开腹等步骤同前。取出胎鼠后（每只孕鼠随机取1只胎鼠），以断头法处死胎鼠，开颅取胎鼠大脑组织；对照组不予缺血处理，直接开腹取胎鼠脑组织，于4%多聚甲醛固定48h，经脱水透明后石蜡包埋切片，片厚约3μm，备用。

1.2.3 HE染色：石蜡切片经二甲苯及梯度乙醇脱蜡水化后，苏木素染色15min，自来水冲洗3min，洗去多余的液体，1%盐酸酒精分化，镜下观察分化程度，自来水冲洗返蓝30min，放入95%乙醇中1min，0.5%伊红染色3min。脱水，透明，中性树胶封片，显微镜下观察，细胞核呈蓝色，细胞质呈粉红色。1.2.4 HIF-1α检测：采用S-P免疫组织化学法检测HIF-1α蛋白的表达。将制备的切片脱蜡，梯度乙醇水化，PBS液洗涤3min×3次（简称洗涤，下同），0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH=6.0）抗原修复后，0.1%胰蛋白酶再抗原修复15min，洗涤，0.1%TritonX-1001滴细胞膜打孔，洗涤，3%双氧水封闭内源性过氧化物酶，洗涤，正常山羊血清封闭10min，勿洗，加小鼠抗大鼠HIF-1α抗体（1∶100），4℃孵育过夜。次日晨充分洗涤后，加生物素标记的羊抗鼠/兔IgG孵育10min，充分洗涤，加链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶10min，充分洗涤，DAB显色，苏木素复染，常规脱水，中性树脂封片。镜下观察，细胞内呈棕黄色者为阳性细胞。应用ImagePro Plus图像分析软件分析染色结果。光镜下同一批次染色切片按左右皮层和海马分别取3个不重复的视野，放大400倍，测定阳性细胞染色平均光密度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 HE染色病理观察

实验组可见不同程度的细胞体肿胀，细胞排列紊乱，细胞核固缩，见于大脑皮层及海马区，可见动物模型建立成功。实验组复氧48h组细胞损伤程度较复氧12h组为重，细胞核固缩明显。对照组大脑皮层及海马排列有序，细胞核大，细胞质较少，见图1。

2.2 HIF-1α免疫组化染色结果

HIF-1α蛋白表达主要分布于大脑皮层，海马等区。实验组复氧8h后HIF-1α蛋白表达较对照组明显增加，12h达到高峰，24h开始明显下降，见图2；对照组、实验组 0h、0.5h、2h、4h、8h、12h、24h及48h蛋白表达量分别为0.2902±0.02230，0.2994±0.04176，0.2960±0.03455，0.3060±0.04053，0.3086±0.03960，0.3276±0.00631，0.3638±0.02168，0.2856±0.00814，0.2808±0.00415；8h 及 12h 组的HIF-1α蛋白平均光密度与对照组比较，其表达量明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；24h及48h组的HIF-1α的蛋白平均光密度与12h组比较，表达量明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

缺氧缺血性脑损伤已成为当今产科和新生儿科十分关注的一种临床疾病，无论是产前、产时还是产后的缺氧缺血性脑损伤都为家庭乃至社会带来巨大的精神及经济上的负担。因此，国内外学者对于缺氧缺血性脑病的研究非常重视。

HIF-1由HIF-1α和HIF-1β两种亚基组成的异二聚体，其中HIF-1α是调节亚基，又称活性亚基，HIF-1β是结构亚基。HIF-1α是缺氧条件下产生的具有转录活性的核蛋白，通过转录及转录后调控使机体和组织对外界产生适应反应，常氧条件下，HIF-1α在泛素-蛋白溶解酶体通路作用下被降解［2］，而低氧条件下，此通路被抑制，使HIF-1α在细胞质中积聚［3］，并与HIF-1β转移入核内，形成稳定的复合物，但是随着细胞氧量的恢复，HIF-1α再次移出细胞核而被降解。近年来，HIF-1α在中枢神经系统中的作用被不断认识［4］，Sheldon 等［5］的研究结果显示：神经元HIF-1α缺陷小鼠在脑组织缺氧缺血后的脑损伤较正常小鼠严重，提示HIF-1α具有脑保护作用。目前很多研究试图通过提高HIF-1α的表达来提高中枢神经系统对缺氧的耐受性，以达到缺血缺氧脑损伤下的脑保护作用［6］。

HIF-1α在缺氧缺血脑损伤中的作用机制仍未完全阐明，目前的研究主要集中于以下几个方面：（1）改善脑缺血后能量代谢障碍［7］：低氧时HIF-1α可通过诱导丙酮酸脱氢酶激酶1的表达，使丙酮酸脱氢酶活性抑制，进而阻断了线粒体三羧酸循环，导致线粒体氧耗量下降，并使得细胞内氧张力增高，从而改善了脑缺血后的能量供应，细胞死亡下降，脑损伤得以减轻［8］；（2）脑缺血后 HIF-1α 可以通过激活靶基因转录促进VEGF表达，从而促进新生血管生成，改善脑血流动力学，使脑缺血得以迅速恢复［9］。此外，研究发现VEGF除了能促进血管形成，还可能通过作用于VEGF受体，使其磷酸化并激活AKt，发挥神经营养和保护功能［10］；（3）HIF-1α 能促进促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）的蛋白表达，EPO是HIF-1α重要的靶基因之一，低氧时诱导HIF-1α积聚，使EPO表达增加，从而发挥脑保护作用［11］。

李丽华等［12，13］对于在体新生鼠神经元细胞缺血缺氧的研究发现缺血缺氧组新生鼠脑组织中的HIF-1α在缺血缺氧后4h表达明显增加，8h达到高峰，24h以后逐渐降低。Stroka等［14］通过免疫组化法发现在体的小鼠脑组织在缺氧5h后，HIF-1α表达达到高峰，12h后降到基线水平。我们通过对缺血后不同复氧时间胎鼠脑组织中HIF-1α蛋白表达的研究结果显示，脑组织中HIF-1α蛋白表达量在复氧8h后开始明显升高，12h达到高峰，24h后下降至正常水平。因此不论是在新生鼠、成鼠还是在胎鼠缺氧后HIF-1α蛋白的表达呈现先升高后降低的趋势，但是达到峰值的时间不同，胎鼠达到峰值的时间最晚，提示胎鼠对缺氧缺血的调节适应较新生鼠及成年鼠缓慢，胎儿期对缺氧缺血的耐受力不同于新生鼠及成年鼠。

综上，宫内缺氧缺血性脑损伤后，胎鼠脑组织中的HIF-1α蛋白在一定时间内明显增高，复氧8～12h达到高峰，之后随着时间的延长，在复氧24h以后HIF-1α蛋白会逐渐回到基线水平，即HIF-1α对于胎鼠脑组织在缺氧缺血后的保护作用亦呈现先增强后减弱的趋势，因此如果在缺氧缺血后复氧的12h内给予相应的处理，抑制HIF-1α的降解，即可达到持续保护脑组织的作用，这将为日后胎儿宫内缺氧缺血性脑病的防治带来新的思路。

［1］杜鹃，尚涛，魏轶兵，等.子宫胎盘缺血对胎鼠体重及神经系统发育影响的研究［J］.中华妇产科杂志，2004，39（4）：221-223.

［2］Semanza GL.Oxygen regulated transcription factors and their role in pulmonary disease［J］.Respir Res，2000，1（3）：159-162.

［3］Jaakkola P，Mole DR，Tian YM，et al.Targeting of HIF-alpha to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation［J］.Science，2001，292（5516）：468-472.

［4］Kietzmann T，Knabe W，Schmidt-Kastner R.Hypoxia and hypoxia-inducible factor modulated gene expression in brain：involvement in neuroprotection and cell death ［J］.Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci，2001，251（4）：170-178.

［5］Sheldon RA，Osredkar D，Lee CL，et al.HIF-1alpha-deficient mice have increased brain injury after neonatal hypoxia-ischemia［J］.Dev Neurosci，2009，31（5）：452-458.

［6］Kasiganesan H，Sridharan V，Wright G.Prolyl hydroxylase inhibitor treatment confers whole-animal hypoxia tolerance［J］.Acta Physiol，2007，190（2）：163-169.

［7］Jones NM，Bergeron M.Hypoxia preconditioning induces changes in HIF-1target genes in neonatal rat brain ［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2001，21（9）：1105-1114.

［8］Papandreou I，Caims RA，Fontana L，et al.HIF-1mediates adaptation to hypoxia by actively downregulating mitochondrial oxygen consumption［J］.Cell Metab，2006，3（3）：187-197.

［9］Matsuda T，Abe T，Wu JL，et al.Hypoxia-inducible factor-1alpha DNA induced angiogenesis in a rat cerebral ischemia model［J］.Neurol Res，2005，27（5）：503-508.

［10］Digicaylioglu M，Garden G，Timberlake S，et al.Acute neuroprotective synergy of erythropoietin and insulin-like growth factor 1［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（26）：9855-9860.

［11］Gu GJ，Li YP，Peng ZY，et al.Mechanism of ischemic tolerance induced by hyperbaric oxygen preconditioning involves up-regulation of hypoxia-inducible factor-1{alpha}and erythropoietin in rats［J］.J Appl Physiol，2008，104（4）：1185-1191.

［12］李丽华，屈艺，毛萌，等.缺氧诱导因子1α在新生鼠缺氧缺血性脑损伤的表达及意义［J］.中华妇幼临床医学杂志，2007，3（3）：126-128.

［13］李丽华，屈艺，毛萌，等.新生鼠缺氧缺血性脑损伤缺氧诱导因子1α表达与神经元凋亡［J］.中国修复重建外科杂志，2007，21（12）：1326-1329.

［14］Stroka DM，Burkhardt T，Desbaillets I，et al.HIF-1is expressed in normoxic tissue and displays an organ-specific regulation under systemic hypoxia［J］.FASEB J，2001，15（13）：2445-2453.

（编辑武玉欣，英文编辑郑华川）

The Expression of Hypoxia Inducible Factor 1Alpha in Fetal Rat Brain Tissue Injured by Intrauterine Hypoxia-ischemia

XI Qi，LIU Xue-min，DU Juan
（Department of Obsterics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the expression pattern of hypoxia inducible factor 1alpha（HIF-1α）in fetal rats′brain tissue injured by intrauterine hypoxia-ischemia.MethodsFetal rats were obtained from 36pregnant Wistar rats at the gestational 19days.The 36pregnant rats were randomly divided into 1control group and 8experimental groups.The pregnant rats of experimental groups were modeled into intrauterine hypoxia-ischemic brain injury，and then brain tissue of fetal rats were obtained at 0h，0.5h，2h，4h，8h，12h，24h and 48h after hypoxia，respectively.The pregnant rats in control group were not modeled and brain tissues of fetal rats were obtained directly.HIF-1α was examined by S-P immunohistochemistry.ResultsThe HIF-1α expression was gradually increased until 8h，reached maximal level after 12h and recovered to basic level by 24h.ConclusionThe expression of HIF-1α in fetal rats′brain tissue undergoes gradual increase and decrease after intrauterine hypoxia-ischemic injury.

hypoxia-inducible factor 1alpha；hypoxic-ischemic brain injured；fetal rat；brain tissue

R361

A

0258-4646（2011）01-0020-04

辽宁省教育厅创新团队计划（2008T208）

奚琦（1984-），女，硕士研究生.

杜鹃，E-mail：duj@sj-hospital.org

2010-08-30