王露，赵玉岩，马冬杰，田雷，郑德禄，杜瑞伶

（中国医科大学附属第一医院内分泌科，沈阳 110001）

增食欲素受体1在营养性肥胖大鼠肾上腺皮质中的表达及意义

王露，赵玉岩，马冬杰，田雷，郑德禄，杜瑞伶

（中国医科大学附属第一医院内分泌科，沈阳 110001）

目的探讨营养性肥胖大鼠肾上腺皮质组织中增食欲素受体1（OX1R）的表达规律，以及下丘脑增食欲素（orexin）系统对其调节作用。方法 高脂饮食诱导构建并评估营养性肥胖大鼠动物模型；免疫组化法检测肾上腺皮质组织中OX1R的表达；侧脑室注射orexin反义的硫代磷酸化-脱氧寡核苷酸（OX-PS-ODNs）干预下丘脑增食欲素系统，分析肾上腺皮质中OX1R的变化规律。结果 大鼠高脂膳食饲养8周后，营养性肥胖组大鼠体质量、体脂含量、Lee′s指数、血糖、胰岛素、甘油三酯、总胆固醇高于对照组（P<0.05）。OX1R的蛋白表达定位于大鼠肾上腺皮质束状带细胞的细胞质中；与正常对照组相比，营养性肥胖大鼠肾上腺皮质中的OX1R的表达升高（P<0.05），且OX1R的表达量与Lee′s指数、血糖、胰岛素、甘油三酯、总胆固醇呈显著负相关（r分别为-0.829，-0.710，-0.801，-0.733和-0.756）。OX-PS-ODNs干预下丘脑orexin系统2d后，营养性肥胖大鼠肾上腺皮质中OX1R的表达明显下降（P<0.05）。结论大鼠肾上腺皮质束状带细胞的细胞质中有OX1R的表达，营养性肥胖大鼠体内orexin系统可能通过下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴参与调控能量代谢。

肥胖；增食欲素受体1；肾上腺皮质；基因表达

增食欲素（orexin）是一种下丘脑神经肽，包括orexin A和orexin B，通过激活G蛋白耦联受体-orexin受体（orexin receptor，OXR）发挥作用。orexin系统参与调节机体的摄食、能量代谢平衡、睡眠-觉醒等重要内分泌代谢生理过程。但关于orexin系统对下丘脑-垂体-肾上腺轴（hypothalamic-pituitaryadrenal，HPA）的调控作用尚不清楚。本研究探讨orexin系统中的重要成员——增食欲素受体1（orexin receptor 1，OX1R）在营养性肥胖大鼠肾上腺皮质中的表达规律，阐明orexin系统在HPA中的作用以及调控能量代谢过程中的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

健康SPF级雄性Wistar大鼠60只，体质量160～180g，由中国医科大学实验动物中心提供。针对orexin基因mRNA启动区设计的反义、错义脱氧寡核苷酸，由大连宝生物技术有限公司合成，末端硫代磷酸化保护修饰，制成反义的硫代磷酸化-脱氧寡核苷酸 （OX-PS-ODNs） 和错义 OX-AS-ODNs。Orexin反义脱氧寡核苷酸序列为 5′CAGACTCCTTGGGTATTTG3′，错义脱氧寡核苷酸序列为5′TGATCCAC CTAGCGTAATTG3′。高脂饲料参照Eun［1］的方法并加以改进。SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒均购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.2 下丘脑orexin系统干预实验：30只肥胖大鼠随机分为肥胖盐水组（侧脑室注射生理盐水）、肥胖反义组（侧脑室注射OX-PS-ODNs）和肥胖错义组（侧脑室注射OX-AS-ODNs）。大鼠给予10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔麻醉，参照大鼠脑冠状面定位图谱行右侧脑室颅骨钻孔，将导管垂直插入脑室，牙托粉固定，局部注射氨苄青霉素抗感染。插管1周后，OX-PS-ODNs、OX-AS-ODNs 10μl（5μg/μl）及等容积生理盐水，每天3次，连续2d［4］。实验结束后，大鼠麻醉下侧脑室注射黑墨水（2μl/只）来验证插管的位置。

1.2.3 生化测定：测定血清血糖（葡萄糖氧化酶法，美国LIFESCAN稳步型血糖仪），血清胰岛素（直接化学发光法，美国SLEMENS），甘油三酯、总胆固醇（生化酶法，日本Determiner-C TG/TC）。

1.2.4 免疫组织化学染色法：取大鼠肾上腺于10%福尔马林中固定，经脱水、透明后包埋为蜡块，每个蜡块各切为4μm的组织切片，SABC法免疫组化染色分析OX1R蛋白的相对表达水平。免疫阳性胞质着色为棕黄色。免疫组化结果用显微镜数码成像系统（日本OLYMPUS BX51）进行拍照，用Imageproplus 5.0软件进行量化分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 高脂膳食诱导大鼠营养性肥胖

大鼠高脂膳食饲养8周后，高脂肥胖组大鼠体质量、Lee′s指数、体脂含量、血糖、胰岛素、甘油三酯、总胆固醇分别高于对照组25.7%、2.9%、19.2%、30.0%、41.0%、63.9%、38.4%（P<0.05）（表 1），提示高脂膳食诱导大鼠发生营养性肥胖，大鼠体内出现脂代谢紊乱。

表1高脂膳食对大鼠体质代谢的影响（±s）T a b.1T h e e f f e c t o f h i g h-f a t d i e t t o r a t me t a b o l i s m（±s）Body weight Lee′s index Body fat contents Blood glucose Insulin Triglycerides Ttotal cholesterol（g） （kg/m2） （%） （mmol/L） （mIU/L） （mmol/L） （mmol/L）Normal group 10 352.44±14.52 297.53±3.42 2.39±0.06 6.94±0.78 11.19±1.28 0.86±0.13 1.64±0.13Obese group 10 442.93±13.591） 306.32±2.151） 2.85±0.131） 9.02±0.911） 5.78±3.421） 1.41±0.121） 2.27±0.731）1）P ＜0.05vs normal group.Group n

2.2 营养性肥胖大鼠肾上腺皮质中OX1R的表达

免疫组织化学染色法分析结果显示：大鼠肾上腺皮质束状带细胞可以表达OX1R蛋白；营养性肥胖组大鼠肾上腺皮质OX1R的表达量（OD值为30.50±1.16）比对照组（OD 值为 22.89±2.71）高出30.4%，两组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）（图1）。

2.3 侧脑室干预实验影响营养性肥胖大鼠肾上腺皮质中OX1R的表达

营养性肥胖大鼠侧脑室给予OX-PS-ODNs、OXAS-ODNs和生理盐水2d后，反义组大鼠肾上腺皮质OX1R表达量（OD值为15.78±2.85）较错义组（OD值为28.76±2.11）低44.5%、较盐水组（OD值为30.48±1.70）低48.6%，反义组与其他两组相比差异有统计学意义（P＜0.05）（图2）。

3 讨论

早期研究发现，表达于下丘脑组织的orexin系统能参与调节机体能量平衡、摄食、睡眠等作用，侧脑室注射orexin A可以使多种实验动物摄食增加，从而与肥胖的发生密切相关［1，4］。也有研究指出，orexin在肥胖及胰岛素抵抗大鼠模型中表达降低，提示orexin可能不是肥胖发生的原因，而是对肥胖发生产生适应性调节作用［4］。本研究结果显示，高脂膳食能诱导肥胖大鼠模型建立，而且体质量、Lee′s指数、体脂含量、血糖、胰岛素、甘油三酯、总胆固醇等指标分别高于对照组。在我们以往的研究中发现，该类模型大鼠下丘脑中orexin的表达降低，OX1R的表达增多，提示orexin敏感性增加可能是肥胖发生的重要病理生理基础［6］。此外，高脂饮食诱导的肥胖大鼠体脂代谢也发生了变化，这与人类单纯性肥胖的自然发生过程相似，有利于单纯性肥胖发病机制的研究。

最近的研究显示，orexin及其功能性受体也存在于周围系统，还能调节神经内分泌轴，如HPA轴［6］。因此，orexin可以作为一个循环激素和（或）自分泌旁分泌物质起作用。orexin系统能调节HPA轴，促进醛固酮、糖皮质激素、儿茶酚胺的分泌及肾上腺皮质细胞的生长等［6］。侧脑室注射orexin能激活大鼠室旁核神经元，还能升高血中促肾上腺皮质激素及皮质酮水平，orexin还能通过OX1R耦联蛋白激酶C通路来刺激牛肾上腺髓质合成儿茶酚胺，OX1R可以负性耦联腺苷酸环化酶依赖级联来刺激猪肾上腺髓质分泌儿茶酚胺［7,8］。本研究中，肥胖大鼠肾上腺皮质束状带细胞的细胞质中有OX1R的表达，且表达量较正常对照组增高。通过给予肥胖大鼠侧脑室插管并注射OX-PS-ODNs作为干预因素，免疫组织化学结果显示，反义组大鼠肾上腺皮质OX1R表达量较其他两组降低，说明OX-PS-ODNs能特异性阻断下丘脑orexin的表达，orexin作为一种循环激素，到达外周肾上腺组织的orexin相应减少，肾上腺皮质OX1R表达也相应减少，提示着orexin对肾上腺激素的刺激作用降低。由于上述肾上腺激素促进动物新陈代谢及能量消耗，因此对该类激素的抑制会导致动物体质量增加。实验动物中枢orexin减少对动物摄食的抑制，部分被外周肾上腺激素的变化抵消，若要达到有效减轻体质量的作用，需在外周对肾上腺轴中orexin及其受体进行干预。这一结论为中枢及外周调控体质量药物的研发提供实验基础及理论依据。

［1］Eun SP，Seong JY，Jin SK，et al.Changes in orexin-A and neuropeptide Y expression in the hypothalamus of the fasted and high-fat diet fed rats［J］.Veterinary Science，2004，5（4）：295-302.

［2］Chandler PC，Viana JB，Oswald KD，et al.Feeding response to melanocortin agonist predicts preference for and obesity from a highfatdiet［J］.PhysiolBehav，2005，85（2）：221-230.

［3］Tang-Christensen M，Kristensen P，Stidsen CE，et al.Central administration of Y5receptor antisense decreases spontaneous food intake and attenuates feeding in response to exogenous neuropeptide Y［J］.Endocrinology，1998，159（2）：307-312.

［4］刘礼斌，廖丽萍，陈洲，等.肥胖大鼠前增食欲素原及增食欲素受体基因表达与下丘脑-垂体-肾上腺轴有关［J］.中华内分泌代谢杂志，2007，23（5）：452-453.

［5］赵玉岩，郭磊，都健，等.高果糖膳食对大鼠下丘脑增食欲素系统的影响［J］.中华内分泌代谢杂志，2004，20（1）：82-83.

［6］Spinazzi R，Gastone G，Paola G，et al.Orexins in the regulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis ［J］.Pharmacol Rev，2006，58（1）：46-57.

［7］Ziolkowska A，Spinazzi R，Albertin G，et al.Orexins stimulate glucocorticoid secretion from cultured rat and human adrenocortical cells，exclusively acting via the OX1receptor［J］.Steroid Biochem Mol Biol，2005，96（5）：423-429.

［8］SpinazziR，RucinskiM，MalendowiczLK，etal.Preproorexinand orexin receptors are expressed in cortisol-secreting adrenocortical adenomas，and orexins stimulate in vitro cortisol secretion and growth of tumor cells［J］.Clin Endocrinol Metab，2005，90（6）：3544-3549.

（编辑武玉欣，英文编辑郑华川）

Expression and Significance of Orexin Receptor 1in the Adrenal Cortex of Diet-induced Obese Rats

WANG Lu，ZHAO Yu-yan，MA Dong-jie，TIAN Lei，ZHENG De-lu，DU Rui-ling
（Department of Endocrinology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo observe the expression of orexin receptor 1（OX1R）in dietary obese rats，and to investigate the regulatory effects of hypothalamus orexin system on OX1R.MethodsThe diet-induced obese rat models were established and evaluated by feeding a highfat diet for 8weeks.Immunohistochemistry was employed to examine the expression of OX1R in adrenal cortex of rats.Lateral ventricular canalization was performed in obese rats，which then

an intra-cerebroventricular injection of OX antisense oligodeoxynucleotide（OX1R-PS-ODNs），in order to intervene hypothalamus orexin system，and to analyze the variation of OX1R.ResultsThere were statistical differences in weight，body fat contents，Lee′s index，blood glucose，insulin，triglycerides and total cholesterol between the high-fat diet group and the control group after 8weeks （P<0.05）.The OX1R protein appeared in adrenal cortex zona glomerulosa.The expression of OX1R was obviously increased in adrenal cortex of high-fat diet rats（P<0.05），and negatively correlated with Lee′s index，blood glucose，insulin，triglycerides and total cholesterol （P<0.05）.The correlation coefficient was-0.829，-0.710，-0.801，-0.733and-0.756respectively.The amount of OX1R in adrenal cortex of high-fat diet rats was significantly decreased after 2days of intra-cerebroventricular injection of OX-PSODN.ConclusionThe expression of OX1R is observed in zona glomerulosa cytoplasm of rat adrenal cortex.Orexin system might be involved in the regulation of modelate-energy metabolism via hypothalamic-pituitary-adrenal（HPA）axis in dietary obese rats.

obese；orexin receptor 1；adrenal cortex；gene expression

R586.9

A

0258-4646（2011）01-0001-03

国家自然科学基金资助项目（30872724）；辽宁省自然科学基金资助项目（20082116）；辽宁省科技攻关层次计划项目（2008225009；2009225010-3）

王露（1985-），女，硕士研究生.

赵玉岩，E-mail：G572@sina.com

2010-10-13