刘一丹,陈 钧＊,丁晓瑜,杨学娟,郭丹钊,2

(1.江苏大学药学院,江苏镇江 212013;2.河南科技学院生科院,河南新乡 453003)

喙果绞股蓝(Gynostemm a yixingenseC.Y.Wu et S.K.Chen.)是葫芦科绞股蓝属多年生草本植物,生于海拔 60～100 m的林下灌丛中,主要分布于江苏宜兴、浙江杭州等地,是中国东南部地区特色资源,与同属植物绞股蓝〔G.pentaphyllum(Thunb.)Makino.〕成分相似,主要含绞股蓝黄酮类及皂甙类成分[1-4]。喙果绞股蓝与绞股蓝属其他 9种植物已成为开发绞股蓝属植物的研究热点[5-10]。

目前,喙果绞股蓝的研究主要集中在采用比色法对总黄酮以及总皂甙的定量测定上[8-9],而未见采用 HPLC测定喙果绞股蓝中皂甙类与黄酮类成分的分析方法的研究。本研究以芦丁、槲皮素为指标性成分,首次建立反相高效液相同时测定喙果绞股蓝中芦丁、槲皮素含量的方法,并测定了不同生长月份的含量动态变化,以期为该资源的基础研究和质量控制提供实验参考。

1 仪器与试药

岛津 LC-20AT高效液相色谱仪 (N2000色谱工作站、LC-20A检测器),Shimadzu UV 2550紫外分光光度计,AT-201电子分析天平 (d=0.01 mg,瑞士),芦丁对照品 (中国药品生物制品检定所,批号 0753- 9910)、槲皮素对照品 (德国,Lot85H0694);甲醇 (色谱纯,国药)、磷酸等其它试剂均为分析纯,水为娃哈哈纯净水。五批喙果绞股蓝地上部分 (7、8、9、10、11月份 )采自江苏省镇江市南山植物园,经江苏大学药学院陈钧教授鉴定为喙果绞股蓝 (G.yixingenseC.Y.Wu et S.K.Chen.)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:大连依利特 SinoChromODS-APC18色谱柱 (4.6 mm ×250 mm,5μm);流动相:采用甲醇-0.4%磷酸水溶液梯度洗脱 (0～20 min,40%∶60%,20～60 min,50% ∶50%,60～75 min,60% ∶40%,75～90 min,70% ∶30%,v/v);检测波长:364 nm;流速:1 mL/min;柱温:30℃。对照品和喙果绞股蓝供试品色谱图,见图1。

图1 对照品和喙果绞股蓝供试品 HPLC图谱

2.2 对照品溶液的制备

精密称定干燥至恒重的芦丁、槲皮素对照品各9.5300 mg、3.6800 mg,至 25 mL容量瓶 ,加甲醇溶解定容,制成含芦丁 0.3812 mg/mL、槲皮素 0.1472 mg/mL的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取,11月喙果绞股蓝粉末 (过 24目筛)2.0 g,置索氏提取中,加石油醚 50 mL,加热回流至提取液无色,放冷,弃去石油醚液,药渣连同滤纸筒挥干溶剂后,移入烧瓶中,精密加入甲醇 25 mL,称定重量,回流提取 3 h,放冷,再称定重量,用甲醇补足失重,精密量取 4 mL,置蒸发皿中蒸干,残渣用甲醇溶解并转移至 1 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,用 0.45μm滤膜滤过,取续滤液,按上述色谱条件,进样 20μL,即得供试品溶液。

2.4 线性关系考察

按“2.2项”下操作,精密吸取对照品溶液稀释1、10 、20、30、40、50倍 ,按上述色谱条件 ,进样20μL,测定峰面积值,以进样量为横坐标 (X),峰面积为纵坐标 (Y),绘制标准曲线,得芦丁的回归方程为:Y=106X-15196,r=0.999 8,槲皮素的回归方程为:Y=3×106X-55589,r=0.999 9;芦丁的线性范围:0.152 5～3.812 0μg,槲皮素的线性范围:0.058 9～1.472 0μg,呈良好线性关系。

2.5 精密度实验

精密吸取对照品溶液,按上述色谱条件,进样20μL,连续进样 5次,以峰面积计算,芦丁、槲皮素日内 RSD分别为:0.7%、1.6%;精密吸取对照品溶液,按上述色谱条件,进样 20μL,连续 3天,每天进样 1次,以峰面积计算,芦丁、槲皮素日间 RSD分别为 1.6%、1.5%,仪器精密度良好。

2.6 稳定性实验

按“2.3项”下操作制备的供试品溶液,分别于3、6、9、12、24 h,按上述色谱条件 ,进样 20μL,以峰面积计算,芦丁、槲皮素的 RSD分别为 0.7%、1.4%,说明供试品溶液在 24 h之内稳定。

2.7 重复性实验

精密称取取同一样品 6份,每份 2 g,照“2.3项”下操作制备供试品溶液,按上述色谱条件,进样20μL,以峰面积计算,测得芦丁、槲皮素的平均质量分数为 0.2425 mg/g和 0.0336 mg/g,RSD分别为1.8%、1.7%。

2.8 加样回收率实验

精密称取,已知含量 11月份喙果绞股蓝样品(过 24目筛)1 g共 6份,加入芦丁对照品溶液(0.12 mg/mL)1 mL,槲皮素对照品溶液 (0.027 mg/mL)1 mL,照“2.3项”下的方法制备供试品溶液,按上述色谱条件,进样 20μL,以峰面积计算,测定芦丁、槲皮素的加样回收率,结果见表1。

表1 芦丁、槲皮素的加样回收率实验结果 (n=6)

2.9 样品测定

精密称取 7、8、9、10、11月份 ,共 5个月份 ,喙果绞股蓝粉末 (过 24目筛)各 2 g,按“2.3”项下操作制备供试品溶液,按上述色谱条件,进样 20μL,以峰面积计算,测定喙果绞股蓝在 7～11月内芦丁、槲皮素平均质量分数,结果见表2。

表2 不同月份喙果绞股蓝中芦丁、槲皮素的含量测定(n=3)

3 讨 论

(1)检测波长选择。对芦丁对照品和槲皮素对照品溶液紫外光谱的测定,Shimadzu UV 2550紫外分光光度计上在 190～500 nm进行扫描,根据所得的紫外吸收光谱芦丁在 357 nm处有最大吸收,槲皮素在 375 nm处有最大吸收,适量混合芦丁和槲皮素对照品溶液,在 364 nm处有最大吸收,综合选择测定波长为 364 nm。

(2)流动相选择。分别用甲醇 -水、甲醇 -磷酸溶液系统,对供试品进行等度洗脱,难以较好分离;分别配制 0.2%、0.4%、0.6%的磷酸溶液,与甲醇配比进行梯度洗脱。结果表明,甲醇 -0.4%磷酸溶液 =(40∶60)洗脱时,目标峰与相邻的色谱峰分离度与色谱峰峰形均好,所以流动相采用甲醇-0.4%磷酸溶液系统,梯度洗脱 (0～20 min,40%∶60%,20～60 min,50% ∶50%,60～75 min,60% ∶40%,75～90 min,70% ∶30%,v/v),各峰分离度及对称性均较好,能为喙果绞股蓝定性鉴别作参考,亦可以作为指纹图谱用于喙果绞股蓝的质量控制。

(3)本实验首次建立 RP-HPLC同时测定喙果绞股蓝中芦丁、槲皮素的含量测定方法,该方法简便、快速、准确度高、重复性好,为喙果绞股蓝质量控制提供实验依据。实验结果表明,喙果绞股蓝中芦丁和槲皮素的含量各具季节性动态变化规律,呈先升高后下降的趋势。芦丁在 8月份时含量最高,平均质量分数达 6.31 mg/g,槲皮素在 9月份时含量较高,平均质量分数达 0.86 mg/g,各月份含量差异较大。这种含量动态变化可能与喙果绞股蓝的生长发育规律、生长环境及物种的遗传性有关。因此,喙果绞股蓝资源的开发利用要充分重视季节性等外部因素,及自身发育规律,为该资源的合理开发和综合评价提供基础条件。

[1] 斯建勇,陈迪华,常 琪.喙果绞股蓝黄酮类化合物的分离及结构测定[J].植物学报,1994,36(3):239-243.

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