湘西慈竹叶中黄酮的提取与测定

2011-01-24蒋剑波周志刚彭丁栋

中国野生植物资源 2011年2期

蒋剑波,周志刚,彭丁栋

(1.吉首大学生物资源与环境科学学院,湖南吉首 416000;2.中南大学化学化工学院,湖南长沙 410083)

黄酮类化合物 (flavonoid)又称黄酮体、黄碱素,是一类以 C6-C3-C6碳架为基本特征的低相对分子质量多酚化合物,广泛存在于自然界中,尤其是在植物界中分布最广。研究表明,黄酮类化合物具有多种生物活性,尤其是其在临床上治疗心血管疾病的强心、扩张冠状血管、增加冠脉血流量、抗心律失常、降压、降低血胆固醇等作用[1]被发现以来,在国内外掀起了从各种植物中寻找和提取天然黄酮的热潮。

20世纪 90年代以来,人们对竹叶的研究发现[2],竹叶提取物 (Ebl)具有良好的抗衰老、抗病毒及保护心脑血管、防治老年退行性疾病等生物学功效。且迄今尚未发现竹叶提取物中任何有毒、有害成分,其安全性大大高于含有有毒白果酸成分的银杏提取物 (EGb)。进一步研究发现,以碳苷黄酮为主的黄酮类化合物是竹叶提取物中的主要功能因子。碳苷黄酮与氧苷黄酮相比具有结构稳定,不易被降解;能深入病灶部位,直接发挥疗效;亲水性增强等特点,有利于药品、食品、化妆品等的开发。因此,对竹叶中黄酮的研究与开发成为人们关注的重点。

慈竹〔Sinocalam us affinis(Rendle)McClure.〕系禾本科竹亚科慈竹属乔木型竹类,秆高 5～10 m,径4～8 cm,原产中国,分布在云南、贵州、广西、湖南、湖北、四川及陕西南部各地[3]。湘西地处湘、鄂、川、黔四省边区,亦有慈竹分布。以往国内对慈竹的研究主要在其栽培技术与环境生态效应[4-5]、竹材利用技术[6]等方面,对其化学成分的研究较少。近年来,黄世德[7]等研究了慈竹沥的化学成分,王琼[8]等研究了慈竹构件和分株水平总黄酮含量的变化及可溶性糖的含量,余文[9]等以醇提法研究了慈竹叶片黄酮的提取工艺及在四川不同地区含量的差异。有关湘西慈竹叶中天然黄酮的提取及测定尚未见报道。本文以浸提 -回流法提取,以分光光度法测定,研究湘西慈竹中天然黄酮的含量及其在不同季节中的变化情况,以期为竹资源的开发利用,服务地方区域经济建设提供科学参考和依据。

1 实验部分

1.1 仪器与药品

紫外可见光分光光度计 (Lambda 6,美国 PE公司),电热恒温干燥箱 (DHG-9071A,上海精宏实验设备有限公司),电子天平 (JA2003N,上海精密科学仪器有限公司),数显恒温水浴锅 (HH-S1,金坛市万华实验仪器厂),固体样品粉碎机 (XA-1,金坛市荣华仪器制造有限公司)索氏提取装置;无水乙醇(AR),丙酮 (AR),无水乙醚 (AR),硝酸铝 (AR),亚硝酸钠 (AR),氢氧化钠 (AR),芦丁标准样 (中国药品生物制品检定所),二次蒸馏水;慈竹叶 (采于湖南湘西吉首市砂子坳乡,经本校资环学院刘世彪教授鉴定)。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集和预处理

在竹林中随机选择 5丛生长发育正常、生活环境较一致的慈竹丛,在每一竹丛中选择直径大小相同 (4～5 cm)的慈竹各 5株,从各个方位均匀采集无伤病虫害竹叶,于 2009年春 (4月)、秋季 (10月)各采一次。将采集的新鲜竹叶洗净、晾干,于 60℃左右烘干至恒重,粉碎,过 40目筛,于磨口瓶中密封干燥贮存。

1.2.2 芦丁标准液的配制及标准曲线

精确称取芦丁标准样品 50.0 mg,置于 50 mL烧杯中,加少量 70%乙醇使之完全溶解,转入 50 mL容量瓶中,再用 70%乙醇定容至刻度,摇匀,得到1.0 mg·mL-1的芦丁标准溶液。分别吸取 0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL芦丁标准溶液分别置于 50 mL容量瓶中,各加 30%的乙醇至25 mL,然后加入 5%的亚硝酸钠溶液 1.5 mL,摇匀,放置 6 min后,再加入 10%的硝酸铝溶液 1.5 mL,摇匀,放置 6 min,加入 4%的氢氧化钠溶液 20 mL,稀释至刻度,摇匀,静置 15 min。以不加芦丁的试剂为空白,用紫外可见光分光光度计测定 510 nm处的吸光度,绘制标准曲线。

1.2.3 慈竹叶天然黄酮提取条件正交试验设计

固定料液比为 1∶20,选定溶剂、溶剂浓度、水浴温度、加热 (回流)时间 4个条件因素,按正交表L9(34)设计正交试验,见表1。

表1 提取条件正交试验表

1.2.4 慈竹叶天然黄酮的提取

准确称取 5.0 g干燥慈竹叶样品,装入提取器中,分别按 1.2.3节中条件提取慈竹叶总黄酮,每次加热回流至样品瓶中液体为无色。为使实验具有比较性,将每次提取步骤统一为:干燥粉碎竹叶 5.00 g→浸泡 (料液比 1∶20)→加热回流→冷却→抽滤→分离叶绿素→抽滤→滤液定容 (250 mL)。

1.2.5 慈竹叶总黄酮的测定

吸取溶液 10.0 mL于 50 mL容量瓶,在 1.2.3节正交试验得出的优化提取条件下,按 1.2.2节方法测定样品,并按回归方程计算样品总黄酮含量。

1.2.6 数据处理

用 Excel2003软件分析处理数据。

2 结果与讨论

2.1 芦丁标准曲线及回归方程

测得不同浓度芦丁标准的吸光度见表2。以浓度 C为横坐标,吸光度 A为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程:A=10.553C+0.0032,相关系数 R=0.999 8,RSD=0.15%(n=3)。

表2 不同浓度芦丁标准的吸光度

2.2 慈竹叶天然黄酮提取条件正交试验结果及提取优化条件

慈竹叶天然黄酮提取条件正交试验结果见表3。

表3 提取条件正交试验结果

根据正交试验结果极差分析方法[10],通过比较四种因素不同水平间的极差 (R)和同一因素不同水平的 K值大小,可以得出,四种因素对提取效果影响大小依次为:A(溶剂)>B(溶剂浓度)>D(回流时间)>C(水浴温度),其中溶剂及其浓度是主要因素,回流时间和水浴温度是次要因素;A2B1D3C2为提取优化条件,即用浸提 -回流法提取湘西慈竹叶的最佳提取条件是 75%的丙酮于 70℃时回流加热4小时。前一结论与文献[11-12]等的结论相吻合或相接近,说明这一结论对于用溶剂 -回流法提取竹叶黄酮具有一定的普遍性。后一结论则与有关文献有所区别。值得指出的是,在实际生产提取工艺中,为了降低能耗,提高效率,当然希望加热时间较短为好,但本文希望得到湘西慈竹叶中总黄酮量的准确值,因此仍选择加热回流 4 h为最佳条件。

2.3 四种因素对慈竹叶总黄酮提取的影响

2.3.1 溶剂对慈竹叶总黄酮提取的影响

3种溶剂 (乙醇、丙酮、乙醚)对慈竹叶总黄酮提取的影响如图1所示。图1表明,固定其它因素不变,不同溶剂对慈竹叶总黄酮提取效果影响大小顺序为丙酮 (k2A)>乙醇 (k1A)>乙醚 (k3A)。许钢[11]比较了乙醇、甲醇、丙酮水浴和超声提取淡竹叶中总黄酮的效果,其影响大小顺序均为丙酮 >乙醇 >甲醇,袁珂[12]以乙醇、甲醇、丙酮索氏法提取高节竹叶中总黄酮时,也得到了同样的结果。本文的结果为上述文献提供了佐证。同时,目前关于竹叶黄酮提取的文献中,以报道单一溶剂 (如乙醇)不同浓度对提取效果影响的居多,对不同溶剂对提取效果影响报道较少,本文研究表明乙醚对提取效果影响低于丙酮和乙醇,这一结果或许对今后竹叶黄酮提取溶剂选择有一定参考价值。

图1 不同溶剂对慈竹叶总黄酮提取的影响

2.3.2 溶剂浓度慈竹叶总黄酮提取的影响

同一溶剂不同浓度对慈竹叶总黄酮提取的影响见图2。结果显示,固定其它因素不变,当溶剂浓度从 50%向 75%变化时,慈竹叶总黄酮提取量随浓度升高而增加,当溶剂浓度从 75%向 100%变化时,慈竹叶总黄酮提取量随浓度升高而呈下降趋势。这一变化趋势与多数竹叶黄酮提取文献的结果是相一致的,表明在提取竹叶黄酮时,欲获得较高的提取量,需要有机溶剂和水的配合,在有机溶剂与水的共同作用下进行提取;而最佳提取效果,则与有机溶剂和水的比例有关。在本文中以 75%的溶剂浓度为最佳。

图2 不同溶剂浓度对慈竹叶总黄酮提取的影响

2.3.3 水浴温度对慈竹叶总黄酮提取的影响

水浴温度对慈竹叶总黄酮提取影响的变化趋势见图3。图3显示,固定其它因素不变,当水浴温度从 50℃向 70℃变化时,竹叶总黄酮的提取量随温度升高而升高,当水浴温度从 70℃向 80℃变化时,竹叶总黄酮的提取量随温度升高而呈现降低趋势。这表明,慈竹总黄酮的提取量大小与水浴温度相关,在 50℃至 80℃范围,存在一个最佳温度,使得慈竹总黄酮提取量达最佳值。本文得到的最佳温度是70℃。

图3 水浴温度对慈竹叶总黄酮提取的影响

2.3.4 加热时间对慈竹叶总黄酮提取的影响

加热时间对慈竹叶总黄酮提取影响的变化趋势如图4所示。图4显示,固定其它因素不变,当加热时间从 2 h向 3 h变化时,慈竹叶总黄酮的提取量会略有下降,而当加热时间从 3 h向 4 h变化时,总黄酮提取量有所增加,这一现象与文献[13]的报道相类似。而文献[14]的研究表明,当提取时间为 4.5 h时,竹叶总黄酮提取量会趋于下降。故在测定时选择加热提取时间为 4 h。

图4 加热时间对慈竹叶总黄酮提取的影响

2.4 不同季节湘西慈竹叶黄酮的含量

称取春、秋季竹叶粉末各 3份,均为 5.0 g,于20倍原料重 75%丙酮溶液 70℃条件下水浴冷凝回流 4 h,至浸提溶剂为无色,脱叶绿素后定容测定总黄酮的含量,吸光度和计算结果见表4。

表4 湘西慈叶中总黄酮含量测定结果

结果表明,春季 (4月)新生竹叶中黄酮含量平均为 13.0 mg·g-1,秋季 (10月)老叶中黄酮含量平均为 12.4 mg·g-1。王琼[8]对四川南充慈竹构件和分株水平总黄酮含量的变化研究发现,慈竹叶总黄酮含量随着月份变化呈现明显的节律性变化:总黄酮含量 1～3月较低,在 4月换叶期达到最大值,以后便迅速下降,5月份出现第一个低谷,6、7月黄酮类化合物略有增加,8月再次降低,进入 9月后又开始回升,到次年 3月都维持在较高的水平,并且最高点 4月的总黄酮含量可达 17.7529 mg·g-1。本文测得的湘西慈竹叶总黄酮含量略低于四川南充慈竹叶,但两者处于同一数量级,并且春季新叶中黄酮含量略高于秋季老叶,这与文献结果是相一致的。