赵宇，武军华，贾培媛，吴少平，高珊，王晨宇，黄春倩，王玉霞

(1.军事医学科学院毒物药物研究所，北京100850;2.北京市疾病预防控制中心，北京100031)

反式激活蛋白-氧依赖性降解结构融合结构域介导蛋白跨膜转运和氧依赖性降解作用

赵宇1，武军华1，贾培媛1，吴少平2，高珊2，王晨宇1，黄春倩1，王玉霞1

(1.军事医学科学院毒物药物研究所，北京100850;2.北京市疾病预防控制中心，北京100031)

目的研究反式激活蛋白(TAT)蛋白转导结构域介导的融合蛋白的跨膜转运，以及氧依赖性降解(ODD)结构域介导融合蛋白在体内外不同氧分压环境中的降解作用。方法将TAT，ODD以及增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列进行融合，构建了TAT-ODD-EGFP融合蛋白基因。将该序列克隆到原核表达载体pET28a中，在BL21工程菌中进行表达，通过亲和柱层析法纯化，得到高纯度的融合蛋白。同方法制备EGFP和TAT-EGFP融合蛋白作为对照。在20%O2和1%O2将融合蛋白与A549，H1299和MDA-MB-231细胞系孵育，荧光显微镜下观察融合蛋白在细胞中的分布以及稳定性。小鼠尾静脉注射不同融合蛋白(10 mg·kg-1)，分别在注射后1，6和12 h处死动物，取脏器在荧光显微镜下观察融合蛋白的分布及稳定性。结果由于EGFP相对分子质量大，无法穿透细胞及组织。TAT可以有效地介导TAT-EGFP进入细胞和动物实体组织，其稳定性不受细胞或组织中氧分压的影响，而TAT-ODD-EGFP进入细胞或组织后，在20%O2条件下迅速降解，但可稳定存在于1%O2细胞及组织中。结论TAT可以有效地转导融合蛋白穿过细胞膜。引入ODD，20%O2下融合蛋白TAT-ODD-EGFP迅速降解，但可以稳定存在于1%O2细胞和组织中，说明TAT-ODD可以转导蛋白进入并靶向存在于低氧的肿瘤组织中。……