徐敬明

（重庆文理学院生命科学与技术学院 重庆 402168）

两种近方蟹线粒体16S rRNA基因序列分析

徐敬明

（重庆文理学院生命科学与技术学院 重庆 402168）

测定了绒螯近方蟹和肉球近方蟹线粒体16S rRNA基因部分片段的序列，其长度分别为529bp和525bp。二者的核苷酸序列A、T、G、C的含量相似，分别为36.3%、37.2%、15.9%、10.6%，35.2%、 37.5%、 17.1%、10.2%；不包括4处插入/缺失位点，两序列间有31个变异位点，核苷酸差异率为5.91%，其中转换18个、颠换13个, 转换与颠换比约为1.4。对国外3种近方蟹的16S rRNA基因序列与本文的2种近方蟹序列一起比对获得512bp的同源序列（含插入/缺失位点）进行分析，A+T的平均含量为73.5%，明显高于G＋C的平均含量，共检测到变异位点67个，简约信息位点19个。基于已知的弓蟹科43种蟹类的16S rRNA基因502bp同源序列获得的系统发生树的拓扑结构表明，Helicana、Eriocheir、Helice、Cyrtograpsus、Metaplax、Brachynotus属的蟹类各自聚为一支，且与形态学分类结果一致，表明其分别为一单系；但Hemigrapsus、Gaetice、Cyclograpsus属的蟹类却没有各自聚为一支，分子数据不支持它们分别为一单系。

绒螯近方蟹；肉球近方蟹；16S rRNA；序列；系统发生

近方蟹（Hemigrapsus）隶属甲壳纲（Crustacea）、十足目（Decapoda）、方蟹科（Grapsidae）、弓蟹亚科（Varuninae），其中绒螯近方蟹（H. penicillatus）和肉球近方蟹（H. sanguineus）不仅外形相似，而且生活环境也基本相同，均栖息于海边岩石下或石缝中；数量较大，是制作蟹稣、蟹酱的原料，具有一定的经济价值[1]。近来，一些学者根据分子系统学的研究将方蟹科提升为方蟹总科（Grapsoidea），弓蟹亚科提升为弓蟹科（Varunidae）[2,3]。动物线粒体 DNA（mtDNA）因其分子量小、母系遗传、比核DNA进化速率快等特征而广泛的应用于进化生物学研究中；而mtDNA 16S rRNA基因有较高的保守性，易于进行PCR引物的设计和扩增，非常适合于种及其以上分类阶元的差异研究[4,5]。16S rRNA基因序列已被广泛用于蟹类的分子系统学研究[6-12]，已有一些学者对部分近方蟹16S rRNA基因序列进行了分析[13-17]。

本研究采用线粒体16S rRNA基因作为分子标记，对产于中国的两种近方蟹进行了序列测定和分析；结合从GenBank下载的有关近方蟹等蟹类的基因序列，进行分子系统关系分析，探讨它们之间的遗传差异及亲缘关系，以期为蟹类的种质鉴定、物种保护和资源评价提供基础的分子遗传学资料，为进一步研究蟹类分子系统学提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用绒螯近方蟹和肉球近方蟹于 2006年 9月采自山东省青岛沿海潮间带岩石滩，保存于 -40℃ 冰箱中备用。每种取3个个体用于序列分析。

1.2 DNA提取

从绒螯近方蟹和肉球近方蟹的步足和螯足中取约50 mg肌肉，采用传统法（酚/氯仿抽提法）从肌肉组织中提取基因组DNA。将乙醇沉淀后DNA溶解入40 μL超纯水，放入4 ℃冰箱6 h，最后-20℃保存备用。

1.3 PCR扩增

以 L2510 5’-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3’和 H3059 5’-CCGGTCTGAACTCAGATCATGT-3’为引物对16S rRNA部分片段进行PCR扩增[18]。扩增时的反应体积为 25 µL，反应液中含 2.5 µL 10×PCR buffer， 2.0 µL dNTPs （2.5mmol/L），2.0µL MgCl2（25 mmol/L），1µL 模板 DNA，引物各0.5 µL（10 µmol/L），0.2 µL Taq 酶（5 U/µL），无菌去离子水补足到25 µL。PCR循环参数为：94 ℃预变性1.5 min后，94 ℃变性30 s，49 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循环39次，然后在72 ℃延伸5 min，于4 ℃保存。

1.4 序列测定

PCR产物用含有溴化乙锭的 1.0 % 琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察、照相。对于扩增效果良好的样品进行回收，回收时用1.0 % 琼脂糖凝胶，TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit（宝生物工程（大连）有限公司）进行回收和纯化，纯化产物送至上海英骏测序公司，用 ABI3730XL测序仪进行正反链双向测序。测序所用引物和PCR扩增时的引物相同。

1.5 数据分析

经仔细核对测序胶图后的正反向序列，均由DNASTAR 软件包（DNASTAR，Inc.，Madison，USA）进行编辑、校对和比对，并对排序结果进行分析；所有序列为两端去引物后的序列。用DNASP软件检测变异位点数和简约信息位点数。用MEGA（Version4.0）软件统计序列的碱基组成，计算种间的遗传距离，进行系统发生和分子进化分析。

2 结 果

不包括引物，绒螯近方蟹和肉球近方蟹的16S rRNA基因片段长度分别为 529bp和 525bp（GenBank登录号分别为：GU731424和GU731425）；每种的3个个体之间没有序列差异。二者核苷酸序列A、T、G、C的含量相似，分别为36.3 %，37.2 %，15.9 %，10.6 %，35.2 %，37.5 %，17.1 %，10.2 %；不包括4处插入/缺失位点，两序列间有31个变异位点，核苷酸差异率为5.91%，其中转换18个、颠换13个（图1）, 转换与颠换比约为1.4。

从GenBank下载其它三种近方蟹的16S rRNA基因序列（种名及 GenBank序列号见图 2），与本文的两种近方蟹序列一起比对获得512bp的同源序列（含插入/缺失位点），除插入/缺失位点外共检测到变异位点67个，简约信息位点19个，A，T，G，C的含量只有略微的差异，平均含量分别为36.6 %，36.9 %，16.3 %，10.2 %，碱基 C的含量最少，A＋T含量（73.5%）明显高于G＋C含量。此种类型的碱基含量与其它蟹类的16S rRNA基因是一致的[2,12,19]。参照Ng2008的蟹类分类系统[3]，将已知的弓蟹科43种蟹类的16S rRNA基因序列（种名及GenBank序列号见图2）进行比对获得502 bp同源序列（含插入/缺失位点），除插入/缺失位点外共检测到变异位点153个，简约信息位点120个，A，T，G，C的含量差异较小，平均含量分别为 36.1%，36.9%，16.8%，10.2%，同样表现出碱基C的含量最少，A＋T含量（73%）明显高于G＋C含量的特点。所有序列之间基于 Kimura-双参数距离模型估计其遗传距离；用 NJ法（Neighbor-Joining）构建分子系统发生树（图2），系统树各结点的支持率以序列数据集 1 000次重复抽样检验的自引导值（Bootstrap value）表示，各分支上的数字为重抽样分析得到的大于50 %的支持率。

图 1 绒螯近方蟹和肉球近方蟹16S rRNA基因片段序列比对Fig. 1 Sequences alignment of the 16S rRNA segment of H. penicillatus and H. sanguineus

由系统发生树的拓扑结构（图2）看出，现有已知 16S rRNA基因分子数据的弓蟹科蟹类中，Helicana、Eriocheir、Helice、Cyrtograpsus、Metaplax、Brachynotus属的蟹类各自聚为一支；而Hemigrapsus、Gaetice、Cyclograpsus属的蟹类却没有各自聚为一支。

3 讨 论

两种近方蟹16S rRNA基因5.91%的种间差异明显低于红螯相手蟹和褶痕相手蟹的16S rRNA基因的差异（8.07%）[19]，以及宽身大眼蟹和日本大眼蟹的16S rRNA基因的差异（12.26 %）[12]；表明两种近方蟹的亲缘关系相对较近，这与二者外形相似甚至其雌性和幼体不易区分等形态特征相符合，因此，16S rRNA基因分子数据支持二者在形态分类上隶属于近方蟹属（Hemigrapsus）。

迄今为止共有日本、克罗地亚、台湾和中国连云港4个地方的肉球近方蟹的16S rRNA基因序列报道过（GenBank号分别为：AB058630、AJ493053、AJ493054、EU367395），上述序列与本研究的 16S rRNA基因序列比对获得了386bp同源序列（无插入缺失），结果是与台湾的序列仅有 2bp的差异，核苷酸差异率仅为0.52 %，远小于Schubart的1.5 %的种间差异标准[20]，二者属于肉球近方蟹的不同地理种群的单倍型，而与其它三地的序列则完全相同。

绒螯近方蟹的16S rRNA基因序列与报道过的日本、法国的序列比对（GenBank号分别为：AB058628、AJ278835），在获得的480bp的同源序列中（无插入缺失），青岛的序列与日本和法国的序列之间分别仅有1bp和4bp的差异，而日本与法国的序列之间的差异也仅为 3bp，它们之间的核苷酸差异率最大仅为0.83 %，也是远小于1.5 %，三者分属于绒螯近方蟹的不同地理种群的单倍型。

这表明各地的绒螯近方蟹和肉球近方蟹的分化时间较短，遗传分化较小；同时也进一步表明原本无绒螯近方蟹和肉球近方蟹分布的欧洲，是由于人为原因将原仅分布于东亚的两种近方蟹传播至欧洲的[16]。

43种弓蟹科蟹类16S rRNA基因系统发生树的拓扑结构（图 2）表明，Helicana、Eriocheir、Helice、Cyrtograpsus、Metaplax、Brachynotus属的蟹类各自聚为一支，与其形态学分类结果一致，分子数据支持其分别为一单系；但Hemigrapsus、Gaetice、Cyclograpsus属的蟹类却没有各自聚为一支，分子数据不支持它们分别为一单系，表现出与形态学分类结果的不一致[3]，因此，它们之间的系统关系还有待于对其更多基因和形态进行更深入研究后得以进一步确定。

图2 弓蟹科蟹类的16S rRNA基因分子系统树(NJ法)Fig. 2 Neighbor-Joining molecular phylogenetic tree of 16S rRNA gene for Varunid crabs

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Sequence analyses of mitochondrial 16S rRNA gene between two species ofHemigrapsus

XU Jing-ming

（College of Life Science and Technology，Chongqing University of Arts and Sciences, Chongqing 402168, China）

Partial sequences of the mitochondrial 16S rRNA gene were determined forHemigrapsus penicillatusandH. sanguineus, and the sequence lengths of them were 529bp and 525bp respectively. The A, T, G and C contents were similar, which were 36.3%, 37.2%, 15.9%, 10.6% and 35.2%, 37.5%, 17.1%, 10.2% respectively. There were 31 different sites (excluding 4 deletion/insertion sites) between two species, including 18 transition sites and 13 transversion sites. The si/sv and ratio of sequence divergence were about 1.4 and 5.91% respectively. Furthermore,512bp homologous segments of fiveHemigrapsusspecies were analyzed. The results showed that the average A+T content (73.5%) was higher than G+C content, and there were 67 variable sites and 19 parsimony-information sites in the nucleotides of the data. Topological structure of the molecular phylogenetic tree constructed by 502bp homologous segments of 16S rRNA gene from 43 species of Varunid crabs with Neighbor-Joining method showed that the species ofHelicana,Eriocheir,Helice,Cyrtograpsus,MetaplaxandBrachynotusspecies were clustered into distinct clades respectively, which indicated the monophyly of the genera respectively. But, the species ofHemigrapsus,GaeticeandCyclograpsuswere not clustered into distinct clades respectively, which revealed that the genera might not be monophyletic respectively.

Hemigrapsus penicillatus；H. sanguineus；16S rRNA；Sequence；Phylogeny

Q178.53;Q953

A

1001-6932(2010)06-0638-05

2010-02-19；收修改稿日期：2010-5-10

重庆文理学院引进人才专项（No.200803）

徐敬明（1963—），男，教授，博士，主要从事动物分子与生理生态研究，电子信箱：xjingming@163.com。