曾 霓，冯国丽，文坤明，曾庆良

(1.遵义医学院2006级本科实习生；2.遵义医学院附属医院胃肠外科，贵州 遵义563000)

Christopher[1]发现，在Dukes A期和B期结直肠癌患者中，有近30%在5年内死于肿瘤复发或转移，提示可能有结直肠癌微转移的存在。而淋巴结是否转移是制定其临床分期、指导手术治疗和判断预后的重要指标之一。研究表明[2,3]，结直肠癌患者机体处于免疫抑制状态，且发生复发和转移时患者机体免疫功能尤为低下。目前结直肠癌患者免疫学功能状态和其淋巴结微转移关系方面的研究尚未见报道。本实验采用PT-PCR方法检测结直肠癌患者淋巴结CK20mRNA（微转移）的表达，同时检测其血清CD4+、CD8+和NK水平探讨结直肠癌淋巴结微转移与免疫功能的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与对象 实验组：本院2008年4月至2009年12月住院的结直肠癌患者21例，其中男14例，女7例，年龄24~78岁；对照组：健康志愿者21例，其中男15例，女6例，年龄24~67岁。；采集上述患者281枚淋巴结、术前3日外周静脉血及健康志愿者外周静脉血各5ml；

排除标准：合并有免疫系统或感染性疾病;60天内接受放、化疗或使用影响免疫功能的药物;合并肿瘤并发症及发生肿瘤远处转移的患者。

1．2 试剂与实验仪器 试剂：Trizol RNA抽提剂、PrimeScripTMRT Reagent Kit、SYBR ○RPremix EXTaqTM (Perfect Real Time)、SimultestTMIMKLymphocyte Kit、CK20基因及内参管家基因GAPDH引物，序列如下：CK20 F：5’-ggacgacacccagcgtttatg-3’，R:5’-caccgtgtgtctggagttgga-3’；管家基因 GAPD H F：5’-tggtgagacgccagtgga-3’，R:5’-gcaccgtcaaggct gagaac-3’。

实验仪器：U-301型紫外分光光度计（日本HITACHI公司）；ICycler iQ型荧光定量PCR仪（美国BIO-RAD公司）；Syngene型凝胶成像分析系统（基因公司）；FACS Calibur流式细胞仪（Becton Dickinson公司）。

1.3 方法

1.3.1 淋巴结CK20mRNA的检测

1.3.1 ．1 淋巴结标本的采集与处理 新鲜标本挤压触诊法行淋巴结检取，置于去RNA酶冻存管于液氮冻存，直至RNA抽提。

1.3.1.2 淋巴结总RNA的抽提 Trizol试剂法提取，测定其OD260/OD280比值，结合1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定所提取RNA的纯度及完整性。

1.3.1.3 cDNA合成 按逆转录试剂盒说明书操作，反应总体系为 20ul：5×PrimeScripTM Buffer(for Real Time)4μl，PrimeScripTM Enzyme Mix Ⅰ 1μl，Oligo dT Prime (50uM)1μl，Total RNA 2μl，RNase Free dH2O 12ul。反应条件为：37℃15 min；85℃ 5 sec。

1.3.1.4 PCR扩增 内参为GAPDH，CK-20扩增产物长度为71bp，GAPDH扩增产物长度为138bp。CK20及内参GAPDH的扩增体系均为20ul：SYBR○R Premix EX TaqTM（2×）10.0ul，CK-20/GAPDH Forward Primer (10uM) 0.4ul，CK-20/GAPDH Reverse Primer(10uM)0.4ul，cDNA 2.0ul，ddH2O 7.2μl。CK20基因PCR反应条件：95℃预变性10sec,1 Cycle；95℃变性 30sec，60℃退火 30sec，72℃延伸1min，40cycles；GAPDH 基因 PCR 反应条件：95℃预变 性 10sec,1 Cycle；95℃ 变 性 30sec，55℃ 退 火30sec，72℃延伸 1min，40cycles。

1.3.1.5 结果判定 PCR扩增产物行4%琼脂糖凝胶电泳，Syngene型凝胶成像分析系统照相记录。

1.3.2 外周血CD4+、CD8+与NK细胞活性的检测所采集之新鲜血液标本立即送本院细胞工程实验室进行检测。

1.4 统计学方法 采用t检验或卡方检验、方差分析，P<0.05为差异有显著性。

淋巴结转移率＝淋巴结转移阳性病例数/总病例数×100%，淋巴结转移度＝转移淋巴结数/检取淋巴结总数×100%。

2 结果

2.1 淋巴结RNA及PCR扩增产物电泳结果

2.1.1 淋巴结RNA电泳鉴定 所提取RNA的OD260/OD280比值均在1.8～2.0，1.5%的琼脂糖凝胶电泳于28s及18s处见两条清晰锐利条带，前者亮度为后者两倍（见图1），表明提取RNA质量较高，能用于后续分子生物学实验。

图1 RNA琼脂糖凝胶电泳图

2.1.2 PCR扩增产物溶解曲线及电泳鉴定

2.1.2.1 PCR扩增产物溶解曲线 PCR熔点曲线峰窄，为单峰，产物特异（见图2）。

图2 CK20 PCR扩增熔解曲线

2.1.2.2 PCR扩增产物电泳鉴定 对PCR扩增产物行4%琼脂糖凝胶电泳，PCR产物电泳为单一目的电泳条带，每条泳道代表一个淋巴结标本的扩增结果，每个标本可扩出两条电泳条带，一条为内参对照GAPDH，另一条为目的基因CK-20（见图3）。

图3 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

2.2 结直肠癌患者淋巴结RT-PCR CK-20mRNA表达与常规病理检查结果 21例结直肠癌患者共收集281个淋巴结，其中DukesA期2例10个、DukesB期17例231个、DukesC期2例40个，平均每例13个。HE染色法检出有淋巴结转移者为2例（10%，2/21）、16枚（6%，16/281），为 Dukes C 期患者。而Dukes A期与B期患者共241枚淋巴结未发现转移；RT-PCR CK-20mRNA法检出有淋巴结转移者 10例（48%，10/21）、140枚（50%，140/281），其中 2例Dukes A期患者10枚淋巴结CK-20mRNA表达均阴性；17例B期者231枚淋巴结中，有8例患者、103枚淋巴结呈阳性表达，占45%（103/231），2例C期患者的40枚淋巴结中有37枚淋巴结呈阳性表达，占93%（37/40）。两种方法检测淋巴结转移率分别为 10%（2/21）和 48%（10/21），其淋巴结转移率之间比较差异有统计学意义(χ2=10，P<0.05)；两种方法检测 281个淋巴结转移度分别为5.7%（16/281）和49.8%（140/281)，其淋巴结转移度差异有统计学意义(χ2=17.087，P<0.05)；RT-PCR CK-20mRNA 方法检测的淋巴结转移度在DukesA、DukesB、DukesC期的表达分别为 0﹪（0/10）、44.59﹪（103/231）、92.5﹪（37/40），在DukesA、B和C期间差异有统计学意义（P<0.05)，随着Dukes分期的增加而升高，见表1。

表1 HE染色和CK-20 RT-PCR方法的结直肠癌患者淋巴结转移度比较

2.3 结直肠癌患者淋巴结RT-PCRCK-20mRNA表达与术前 CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的 检 测 结 果手术前结直肠癌患者血 CD4+、CD8+、CD4+/CD8+与健康对照组比较差异均具有统计学意义（P<0.05），CD4+、CD4+/CD8+低于健康对照组，CD8+高于健康对照组（P<0.05），见表2；将结直肠癌患者肠系膜淋巴结CK-20mRNA阳性表达者（即有转移者）重新进行Dukes分期（即 Dukes A’、B’和 C’期）后发现：手术治疗之前，A’、B’期患者血清 CD4+、CD4+/CD8+高于C’期（P<0.05）；A’期患者血清 CD8+低于 C’期（P<0.05），见表3。且新Dukes分期与血清CD4+呈负相关（r＝-0.497，P<0.01）；与 CD4+/CD8+呈负相关（r=-0.714,P<0.01）；与 CD8+呈正相关（r=0.945,P<0.01）。

表2 对照组与结直肠癌患者术前、术后血CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比较

表3 结直肠癌患者术前 Dukes A’、B’、C’期的血CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比较（x±s）

3 讨论

3.1 RT-PCR法检测结直肠癌淋巴结CK-20mRNA表达的临床意义恶性肿瘤的淋巴结是否转移是制定临床分期、指导手术治疗和判断预后的重要指标之一。Christopher[1]发现，在Dukes A期和B期结直肠癌患者中，有近30%在5年内死于肿瘤复发或转移，提示可能有结直肠癌微转移的存在。大量研究资料也表明[2,3,4]，恶性肿瘤的微转移是一个独立的判断预后的指标。其价值优于传统分期方法。CK20是一种具有严格上皮特异性的癌细胞标志物，非上皮来源组织或细胞如正常血液，骨髓和淋巴结不表达，在肿瘤侵袭、转移、扩散到其他组织中时始终保持稳定[5]。其组织特异性强，满足高灵敏的RT-PCR法对靶RNA的特殊要求，是检测结直肠癌微转移敏感而特异的指标[6]。本实验采用常规病理组织学和RT-PCR方法检测结直肠癌患者的淋巴结CK-20mRNA表达的结果显示：淋巴结转移率分别为10%和48%，淋巴结转移度分别为5.7%和49.8%，两种方法在淋巴结转移率和淋巴结转移度的检出差异均有统计学意义；RT-PCR方法DukesA、B、C期的淋巴转移度与常规病理组织学比较差异有统计学意义；常规组织病理学检查阴性的Dukes A、B期患者241枚淋巴结中，经RT-PCR法检测CK-20mRNA表达后发现有8例Dukes B期患者103枚淋巴结呈阳性表达，这8例患者的分期应提升为Dukes C期。其结果表明：在对结直肠癌淋巴结转移的检测中，RT-PCR方法检测结直肠癌患者的淋巴结CK-20mRNA表达较常规病理组织学方法更加可靠和敏感。RT-PCR CK-20mRNA方法对结直肠癌淋巴结微转移的检查更能精确其临床分期、指导临床手术治疗和判断预后。

3.2 结直肠癌患者免疫功能与淋巴结CK-20mRNA表达的关系 国内外实验显示[7，10]，T淋巴细胞亚群及NK细胞活性是反映肿瘤患者的机体免疫功能状态常用指标。我们的试验结果中，结直肠癌患者CD4+、CD4+/CD8+的检测结果均低于健康对照组，而CD8+明显高于健康对照组（P<0.05），这与既往研究结果一致[11]。现有理论认为[8,9]，当患者处在免疫功能低下等条件时，休眠的肿瘤细胞可摆脱抑制状态而持续增殖，并发展为临床显性转移。我们对采用RT-PCR CK-20mRNA方法检查淋巴结呈阳性表达为淋巴结转移者重新Dukes分期后，比较其CD4+、CD8+和CD4+/CD8+发现：Dukes A’与 C’期、B’与 C’期之间差异具有统计学意义（P<0.05），见表3，而新Dukes分期与血清 CD4+之间呈负相关（r＝-0.497，P<0.01），与血 CD4+/CD8+之间呈负相关（r=-0.714,P<0.01），与血清CD8+之间呈正相关（r=0.945,P<0.01）；而结直肠癌患者淋巴结CK-20mRNA的阳性表达（即淋巴结转移度）在、DukesA、B和C期中存在明显差异、而且呈正相关，见表1。上述实验结果表明，结直肠癌患者的细胞免疫功能较正常人明显低下。而其淋巴结微转移的发生与患者的免疫功能明显低下或抑制密切相关，即随着结直肠癌患者Dukes分期的增高，其淋巴结微转移的发生率明显增高，而患者免疫功能状态也更为低下。

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