几种激素对结球甘蓝花药愈伤组织诱导的影响

2010-11-27王神云李建斌万雁玲丁万霞江苏省农业科学院蔬菜研究所江苏南京210014

长江大学学报(自科版) 2010年8期

王神云，李建斌，王红，万雁玲，丁万霞 (江苏省农业科学院蔬菜研究所，江苏南京210014)

王神云，李建斌，王红，万雁玲，丁万霞
(江苏省农业科学院蔬菜研究所，江苏南京210014)

以结球甘蓝(Brassicaoleraceavar.capitata)2个基因型475和476为材料，研究了KT、2,4-D、6-BA对结球甘蓝花药愈伤组织诱导的影响。结果表明，2,4-D在结球甘蓝花药诱导培养中作用最大，KT次之，而6-BA的作用基本可以忽略。激素互作效应中，2,4-D对结球甘蓝花药诱导培养作用基本不受6-BA的影响，2,4-D与KT的互作效应显著，KT与6-BA的互作效应相对复杂。激素组合中以2.0 mg/L 2,4-D+ 1.0 mg/L KT(H7处理)的愈伤组织诱导率最高。

结球甘蓝(Brassicaoleraceavar.capitata)；花药培养；激素；愈伤组织；诱导率

自Guha等[1]1964年首次从毛曼陀罗(Daturainoxia)建立花药培养以来，该技术一直受到遗传育种界的关注，近年来进展很快，其中茄科(Solanaceae)和禾本科(Poaceae)居多[2，3]。十字花科蔬菜中，萝卜(Raphanussativus)[4]、花椰菜(B.oleraceavar.italica)[5]、大白菜(B.rapassp.pekinensis)[6]等也开展了花药培养的研究并取得一定成果。植物的花药培养一般都是通过培养基中加入激素诱导愈伤组织产生，再促使愈伤组织分化形成植株，培养基中激素的种类、浓度和配比，常常对诱发小孢子启动、分裂、生长和分化具有很大的影响，是花药愈伤组织形成的主要因素，但不同植物或同种植物不同基因型要求的激素组合和浓度有所区别[7～9]。

结球甘蓝(Brassicaoleraceavar.capitata)是我国栽培面积较大的蔬菜作物之一，在蔬菜的周年供应中占有重要的地位。然而，国内对结球甘蓝花药培养影响因子的研究甚少。陈世儒等[10]通过皱叶甘蓝花药培养获得了单倍体植株，王超楠等[11]对羽衣甘蓝(B.oleraceavar.acephala)进行花药培养并获得了单倍体植株。这些研究虽获得一定成功，但存在诱导率较低等问题。本研究以结球甘蓝2个基因型为材料，选用KT、2,4-D、6-BA 3种激素研究不同激素配比、浓度对结球甘蓝花药愈伤组织诱导的影响，以期为建立完善的结球甘蓝花药培养体系提供依据，进而为结球甘蓝花药培养育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试结球甘蓝基因型为475、476，由江苏省农业科学院提供。2009年7月播种，高畦栽培过冬。2010年3～5月陆续开花，于初花期从生长健壮、无病虫害的结球甘蓝植株上取绿色、长2～4 mm花蕾带回实验室进行花药培养。

主要药剂2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)和激动素(KT)均购自上海化学试剂公司。

1.2 方法

(1)材料的处理与培养取新鲜的花蕾，用体积分数75% 酒精浸泡60 s，再浸入质量浓度0.1% HgCl2溶液中消毒8 min后，用无菌水冲洗3次，然后置于垫有消毒滤纸的培养皿中，吸去多余水分，用镊子剥开花蕾，取下花药备用，接种到培养基中。以B5(5 g/L 琼脂，60 g/L蔗糖，pH 5.8)为基础培养基。

(2)激素组合的诱导培养以B5培养基为基础培养基，激素配比按正交试验设计，每个处理9皿，每皿15个花药进行培养，以筛选结球甘蓝花药培养诱导愈伤组织的最佳激素组合。

(3)培养条件接种后先在30 ℃下暗培养2 d，然后转入25 ℃暗培养2周左右，再转入25 ℃，光强为3000 ～ 4 000 lx，12 h/12 h光/暗条件下培养，3周左右进行愈伤组织统计。

(4)数据处理试验数据利用正交设计软件和DPS软件进行处理。诱导率(%) =花药胚状体或愈伤组织块数/接种花药数×100。

2 结果与分析

2.1 结球甘蓝花药愈伤组织的形成和发生

将花药接种到愈伤诱导培养基上(图版Ⅲ图1A)后，先在30 ℃下暗培养2 d，然后转入25 ℃暗培养2周左右，再转入25 ℃光培养室培养，花药陆续膨大，花药开始发生纵裂进入分裂期，形成结构疏松而透明的组织(图版Ⅲ图1B)；随后细胞团继续分化，形成一团没有分化能力的愈伤组织块(图版Ⅲ图1C)。结果显示，不同预处理时间和培养基上的花药都能诱导出愈伤组织，愈伤先从药丝口处形成；接种到愈伤诱导培养基上30 d后，没有形成愈伤组织的花药逐渐发褐死亡。

2.2 激素对结球甘蓝花药愈伤组织诱导的影响

(1)不同激素对结球甘蓝花药愈伤组织诱导的影响从图2和表1可以看出，2,4-D浓度越高，结球甘蓝花药愈伤诱导率越高，当2,4-D的浓度达到2.0 mg/L时，475、476 2个材料愈伤诱导率达到最高，分别是28.59%和41.28%，而且2,4-D在2个基因型中诱导率极差较大，分别是19.26%、24.98%，说明2,4-D对结球甘蓝花药培养影响较大；图1的6-BA的效应曲线表明，2个基因型475、476在未加入6-BA的培养基上愈伤诱导率最高，随着培养基中加入6-BA浓度的增大，愈伤诱导率发生下降的现象，但是幅度很小，分别是1.86%和3.87%，说明6-BA在结球甘蓝花药培养中的影响很小；从KT的曲线效应图看出，KT浓度为1.0 mg/L时475和476愈伤诱导率最高，分别是20.00%、32.76%，当KT浓度达到2.0 mg/L时，诱导率稍有下降，2个基因型随KT浓度的改变诱导率振幅分别为2.96%和6.09%，说明KT对结球甘蓝花药培养有一定的影响。结果表明，参试的3种激素及试验浓度范围内，2,4-D的浓度对结球甘蓝花药培养影响最大，其次是KT，6-BA基本无影响。

图2 不同激素对结球甘蓝花药愈伤组织诱导影响的效应图Figure 2 The effects of different hormone on anther callus induction

(2)不同激素组合对结球甘蓝花药愈伤诱导培养的影响由表1可以看出，各个激素组合的培养基都能诱导出一定数量的愈伤组织，激素组合中2.0 mg/L 2,4-D+ 1.0 mg/L KT 2个基因型的花药愈伤诱导率都最高，分别达到35.56%和55.56%，而激素组合0.5 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L

表1 正交设计不同激素组合处理花药愈伤组织诱导率Table 1 The callus induction frequency of the different hormone compositions

KT，2个基因型愈伤诱导率均最低，只有4.44%。尽管不同的激素组合的花药愈伤诱导率存在较大的差别，2个基因型的极差分别为31.12%和51.12%，但不同的激素组合处理2个基因型愈伤诱导效果基本无区别。结果表明，2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L KT激素组合的结球甘蓝愈伤诱导效果最好。

3 讨论

植物的花药培养一般都是通过培养基中加入激素产生愈伤组织，再促使愈伤组织分化形成植株，激素的种类、浓度和配比，对诱发小孢子启动、分裂、生长和分化影响很大。本研究选用的2,4-D、6-BA、KT中，2,4-D对结球甘蓝愈伤和胚状体形成影响最大，这与陈晓等[7]、杨博智等[8]等在辣椒上的研究结果一致，可能在花药离体培养过程中，2,4-D对花粉的启动、分裂、形成愈伤组织和胚状体起着决定性的作用，但2,4-D浓度上限还有待进一步研究。

本研究的正交试验设计结果表明，结球甘蓝花药愈伤诱导最优激素组合为2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L KT，当2,4-D为2.0 mg/L时，KT为2.0 mg/L，诱导率下降了10%以上；当2,4-D为2.0 mg/L时，6-BA为0 mg/L时诱导率最高，而6-BA为 0.5 mg/L和1.0 mg/L，诱导率均降低，可能6-BA浓度梯度范围设置在0～0.5 mg/L间，结球甘蓝花药愈伤诱导较敏感，或者6-BA对KT影响结球甘蓝花药愈伤诱导有负效应，但影响很小；当3种激素同时加入培养基中，结球甘蓝花药愈伤诱导率变幅比较大，即影响大。激素间的互作效应比较复杂，因此激素对结球甘蓝花药愈伤诱导的传导机制网络有待深入研究。前人对茄科和禾本科作物的研究[2，3]表明，愈伤组织的诱导除受培养基激素的种类和配比影响较大外，还受植物基因型、花药发育时期、花蕾预处理等影响，所以要建立完善的结球甘蓝花药愈伤组织诱导体系还需要进一步深入研究。本研究为结球甘蓝花药愈伤组织诱导体系的建立奠定了必要的基础。

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2010-08-25