香根草种子外植体组织培养与快速繁殖

2010-11-27朱桂才任文双

长江大学学报(自科版) 2010年5期

关键词：香根菌苗丛生

姚振，朱桂才，任文双，陈汉

(长江大学园艺园林学院，湖北荆州 434025)

香根草种子外植体组织培养与快速繁殖

姚振，朱桂才，任文双，陈汉

(长江大学园艺园林学院，湖北荆州 434025)

为建立香根草(Vetiveriazizanioides)种子的组织培养和快速繁殖体系，以香根草种子为外材料，进行了种子萌发、丛生芽诱导、愈伤组织诱导与分化及生根研究。结果表明，种子在采收初期发芽率达到90%以上，4 ℃低温贮藏能有限延长种子的寿命；无菌苗丛生芽诱导系数高达7.3；在MS培养基上，0.5 mg/L的2,4-D对种子愈伤组织诱导效果最佳；愈伤组织在MS + 6-BA 2.0 mg/L + IAA 1.0 mg/L上分化率达到55.1%，繁殖系数为15.4；在添加0.2 mg/L IAA的MS培养基上，生根培养效果较好。

香根草(Vetiveriazizanioides)；种子；组织培养；快速繁殖

香根草(Vetiveriazizanioides)又名岩兰草，是自然界具有最长根系的多年生禾本科高大草本植物，具有生物量大、分蘖迅速、适应性强、生态幅度宽、易栽种易管理等特点[1]。由于香根草在提取香根油、制造纸张、编织手工艺品、驱虫治病、保持水土、净化污水、土壤改良、受损生态环境的修复以及用作饲料、燃料等方面的作用，受到各国政府、科学家和生产者的高度重视。香根草被全球100多个国家和地区引种栽种，用于水土流失治理与污染环境的改良，绝大多数都取得了良好效果，从而被称为“神奇牧草”[1～4]。

虽然香根草生态工程受到广泛重视和应用，然而种苗缺乏严重制约着进一步推广，而导致种苗缺乏的主要原因是繁殖速度过慢[5]。生产上通常靠分株或分蘖进行繁殖，为了提高香根草的繁殖系数，国外已经通过花序组织[6～8]、叶[8～10]及幼苗的其它部分[11]建立了再生体系，国内也有相关报道[12，13]。

香根草分为开花和不开花2种，在印度北部发现的野生种大部分是有性繁殖，而印度南部2种习性都有发现[14]。2002年在广东吴川野外采集到的香根草种子，成功繁殖出香根草幼苗，表明广东吴川香根草属于有性繁殖型，也反映了天然香根草之所以成群落分布的原因[15]。刘金祥等[16]利用种子繁殖香根草，并进行了有性繁殖植株的生物学观察。近期的研究表明，香根草在湖北的引种和种子繁殖是成功的[17]。

本研究在了解香根草种子发芽率、贮藏条件的基础上，利用种子建立无菌体系，以无菌苗为材料进行丛生芽诱导，以种子为外植体进行组织培养，进一步研究激素配比对丛生芽、愈伤组织诱导与分化以及生根诱导的影响，建立以种子为材料的组织培养和快速繁殖体系，对于利用有性繁殖的变异，选育矮化、抗旱、耐寒和绿期较长的新品种具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用香根草种植于长江大学园艺园林学院实践教学基地，为2007年和2008年采收的种子。

1.2 方法

(1)贮藏温度对种子寿命的影响将2007年10至11月采收的种子，设置2种贮藏条件，即室温保存和4 ℃低温保存。贮藏的时间为10、12、14、17、18个月，贮藏后每次随机抽取种子50粒，25 ℃恒温培养2周后，记录发芽的种子数目，计算发芽率。

(2)丛生芽的诱导将种子用自来水冲洗数次，75%的酒精消毒30 s，然后转入0.1%的升汞中浸泡8 min，最后用无菌水冲洗数次，晾干后转入MS培养基中25 ℃恒温培养。

当无菌苗长出2～3片叶时，转入从生芽诱导培养基中进行丛生芽诱导。设计4个处理，2种诱导培养基以MS添加4.0 mg/L 6-BA为基本培养基，分别添加IAA和IBA，使用浓度为0.2 mg/L。每种丛生芽诱导培养基中的幼苗分别作剪叶和不剪叶处理。剪叶处理是将无菌苗上部的叶片剪掉一部分，然后将植株轻轻插入丛生芽诱导培养基中，剪叶处理的植株在几天后会重新长出新叶，继续剪叶处理，持续直到有丛生芽的产生为止；不剪叶处理作对照。

每个处理3瓶，每瓶接种5颗，3次重复。从丛生芽出现开始，每隔5～7 d记录一次丛生芽数量，3个月后记录总数，计算丛生芽诱导系数。丛生芽诱导系数=每瓶丛生芽总数/5。

(3)以香根草种子诱导愈伤组织将种子置于愈伤组织诱导培养基上，诱导培养基设置2,4-D浓度4个水平(0、0.5、1.0、2.0 mg/L)，每处理种子50粒。分别在2周和4周以后记录愈伤组织诱导率。愈伤组织诱导率(%)=(产生愈伤组织的种子数量/种子总数)×100。

(4)继代分化培养将种子愈伤组织转瓶于继代分化培养基上，继代分化培养基以MS培养基添加1.0 mg/L的NAA为基本培养基，设2种6-BA浓度(1.0、2.0 mg/L)，记录愈伤组织分化率、繁殖系数。愈伤组织分化率(%)=(分化的愈伤组织数目/愈伤组织总数)×100，繁殖系数=愈伤组织分化的芽总数/分化愈伤组织总数。

(5)生根诱导与移栽分化的愈伤组织切成带单个芽的小片和直接用无菌苗诱导的香根草丛生芽，剪掉叶片至1～2 cm长度，2种材料转瓶于3种生根诱导培养基上。3种生根培养基分别为：MS + NAA 0.2 mg/L和MS + NAA 0.2 mg/L + IAA 0.2 mg/L，以MS培养基为对照。

直接用无菌苗诱导的丛生芽分为单株插入诱导生根培养基中，采用MS培养基为基本培养基，蔗糖30 g/L及琼脂8 g/L，pH5.8。每个处理13棵植株，每瓶1棵。分化的愈伤组织带单个芽切片插入诱导生根培养基中，每处理15棵，每瓶1棵。实验过程中记录生根数、芽数，计算生根率。生根苗炼苗后，常规方法移栽。

2 结果与分析

2.1 种子萌发率测定及贮藏条件

图1 贮藏时间和贮藏温度对香根草种子发芽率的影响Figure 1 Effects of storage time and temperature on seed germination rate of vetiver

室温下保存的种子前3次发芽率分别为97%、84%、68%，最后2次没有种子萌发。冷藏条件下的发芽率前3次与室温下接近，分别为94%、89%、65%，后2次分别为45%、8%。从发芽率的结果看，初期90%以上的发芽率是远高于有关报道的。采收初期种子的发芽率很高，甚至全部萌发，但随时间的推移发芽率慢慢下降(图1)。室温下贮藏种子的时间不能超过14个月，否则发芽率大幅下降。低温贮藏对于延长种子寿命是有利的，但延长的时间也是有限的，低温下贮藏不能超过17个月。

2.2 无菌苗的丛生芽诱导

种子接种于MS培养基上，7 d后种子开始发芽，13 d后种子发芽率为96.7%。无菌苗转入丛生芽诱导培养基后，约1个月产生大量丛生芽，3个月丛生芽诱导系数达到最高值。4个处理的丛生芽诱导系数差异不显著(F=3.816，P=0.092)。从表1可以看出，2种激素组合都能够诱导出丛生芽，培养基中添加6-BA + IAA的诱导效率要高于添加6-BA + IBA的处理，但差异不显著(F=3.659，P=0.104)；剪叶处理的丛生芽诱导系数显著高于不剪叶处理(F=8.414，P=0.027)。

表1 植株处理方式和培养基对香根草丛生芽诱导的影响Table 1 Effects of plant treatment and media on clustered shoots induction of vetiver

注：S-N-K法显著性检验，同列中不同字母表示在P=0.05水平上差异显著。

表2 2,4-D浓度对香根草种子愈伤组织诱导的影响Table 2 Effects of different concentration of 2,4-D on seed callus induction of vetiver

2.3 愈伤组织诱导

接种5 d，对照组种子开始露芽。在2,4-D诱导的情况下，种子前期出现大量带芽的愈伤组织，随着诱导时间的延长，芽逐渐消失。从最终诱导率看，0.5 mg/L 2,4-D浓度处理愈伤诱导率最高，达到了100%，较低浓度的2,4-D有利于诱导愈伤组织的形成(表2)。较高浓度2,4-D在早期可以抑制芽的生长，但最终愈伤诱导率降低。

2.4 继代分化培养

(1)6-BA对愈伤组织分化的影响继代4 d后2.0 mg/L浓度下的愈伤组织开始分化，6 d后1.0 mg/L浓度下的愈伤组织开始分化。1.0 mg/L浓度下平均分化率为27.4%，2.0 mg/L浓度下平均分化率为55.1%，从研究结果看，2.0 mg/L的6-BA有利于愈伤组织的分化，1.0 mg/L的6-BA有利于愈伤组织的继代培养。

(2)繁殖系数从表3可以看出，2.0 mg/L的6-BA能够增加分化的繁殖系数。1.0 mg/L 6-BA及1.0 mg/L NAA激素诱导下，33个愈伤组织分化了9个，分化芽数121个，繁殖系数为13.6，2.0 mg/L BA及1.0 mg/L NAA激素诱导下，37个愈伤组织分化了20个，分化芽数309个，繁殖系数为15.4。不同的愈伤组织分化的芽数在4到30之间。

表3 不同6-BA浓度下愈伤组织分化的繁殖系数Table 3 Propagation coefficient of callus differentiation on different concentration of 6-BA

2.5 生根诱导

(1)采用无菌苗诱导的香根草丛生芽的生根诱导无菌苗诱导的丛生芽分为单株插入诱导生根培养基中，4周后，植株生根并产生分蘖。结果表明，从2个处理的无菌苗生根过程中产生的分蘖总数上看，添加NAA和IAA处理分蘖数的平均值为7.8，而单独使用NAA的处理为3.9，表明同时添加NAA和IAA有利分蘖的诱导。

几乎所有的植株都可以在生根诱导培养基上生根，生根根数的平均数差异不大，同时添加NAA+IAA处理的为4.1，添加IAA处理的为3.6，根数从1到9，差异很大，个别不生根。试管苗在无激素的MS培养基上也能生根，但根系细弱、生长缓慢。

表4 NAA与IAA对带芽愈伤组织切片生根的影响Table 4 Effects of NAA and IAA on rooting of callus slices

(2)带芽愈伤组织切片的生根诱导 20 d后，分化苗开始生根，并发出很多小芽(表4)，带单个芽的愈伤组织切片在2种培养基下产生的芽数相近，但培养基MS+0.2 mg/L IAA的生根率略高于培养基MS + 0.2 mg/L IAA + 0.2 mg/L NAA的。

3 小结与讨论

3.1 香根草种子的萌发与寿命

香根草种子在剥离颖和稃前，有些是空粃，含有种子的颗粒本身带有的病菌使得种子生活力下降，萌发时污染，这些可能是萌发低率的原因。前期的研究表明香根草种子的萌发率低于9.5%[17]，而本研究的发芽率在90%以上，可能是前期的研究中种子带真菌和空秕的原因。香根草是一种典型的热带植物，但适应性强，可在10～45 ℃的地区下生长[18]，但本研究区域，由于冬季的低温，结实穗比较少。热带植物的种子寿命一般比较短，低温贮藏可以延长种子的寿命。由于研究区域处于长江流域，香根草的有效结实穗比较少，采收种子有限，研究受到种子数量的限制，没能准确得知种子发芽率下降的准确时间，只是确定了种子发芽率下降大致的时间段。总的说来，香根草种子的寿命在2 a以内，限制了种子的长期保存和利用。种子寿命详细资料的获得需要进一步的研究。

3.2 剪叶处理可以促进丛生芽诱导

禾本科植物的快速繁殖一般用在遗传转化、优良植株的繁育等方面。利用无菌苗诱导丛生芽的方法比传统的分蘖、插条、切顶等方法简便，并且不经过愈伤组织阶段直接诱导丛生芽可避免产生大量的变异，耗材少、不受季节限制、增殖效果显著。本研究采用细胞分裂素和生长素结合，成功诱导了香根草的丛生芽，剪叶处理比不剪叶处理的丛生芽诱导率要高，可能是剪叶削弱了植株的顶端优势，促进了腋芽的发育。生长素IBA和IAA也在丛生芽的诱导中起了作用，使用IAA的效果要好于IBA。香根草无菌苗植株比较高大，在MS培养基下产生丛生芽比较慢，这种剪叶处理在快速繁殖过程中，一方面可以节约空间，另一方面增加了繁殖的系数，具有重要的应用意义。该项技术可能可以应用在禾本科植物，如水稻、小麦的组织培养和遗传转化中。

3.3 2,4-D在成熟胚愈伤组织诱导中的作用

在诱导成熟胚愈伤组织过程中，2,4-D是用得最为广泛的生长素类激素。水稻诱导愈伤组织，2,4-D是诱导愈伤组织的重要因素，在一定浓度范围内，2,4-D浓度越高，出愈率越高[19，20]。本研究采用2,4-D也成功诱导了香根草种子的愈伤组织。

3.4 生根诱导

来源于种子直接诱导的丛生芽的生根诱导与愈伤组织分化幼苗的生根诱导存在很大的区别，主要表现在生根过程中分蘖数的差异。愈伤组织分化幼苗的生根诱导中分蘖产生芽数多数在10以上，可能是研究中肉眼可见的带单个芽的愈伤组织切片带有很多芽体。在根的诱导中，NAA和IAA均对生根有促进作用，在生产应用中可以适当添加这些激素促进生根。

[1]刘金祥，陈燕．我国大陆唯一的大面积成群落分布的优良水土保持植物——香根草的用途与保护问题[J]．草业科学，2002，19(7)：13～16．

[2]程洪．香根草在我国的应用及研究综述[J]．水土保持通报，1998，18(3)：77～81．

[3]Xu L Y.The international vetiver workshop[J].Vetiver Newsletter,1997,18:65～68.

[4]Ruth E L.Compact callus induction and plant regeneration of a non-flowering vetiver from Java[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture,2000,62:115～123.

[5]夏汉平，刘世忠．香根草优良生态型筛选研究[J]．草业学报，2003，12(2)：97～105．

[6]Keshavachandran R,Khader M A.Growth and regeneration of vetiver (Vetiveriazizanioides(L.) Nash) callus tissue under varied nutritional status[A].Edison S,Ramana K V,Sasikumar B,etal.Biotechnology of Species,Medicinal and Aromatic Plants.Proceedings of National Seminaron Biotechnology of Spices and Aromatic Plants[C].Indi,Calicut,1997.60～64.

[7]Nanakorn M,Surawattananon S,Wongwattana C,etal.Invitroinduction of salt tolerance in vetiver grass(VetiveriazizanioidesNash)[J].J Weed Sci Tech,1998,43:134～137.

[8]Sreenath H L,Jagadishchandra K S,Bajaj Y P S.XXVIIVetiveriazizanioidesNash (Vetiver Grass):Invitroculture,regeneration,and the production of essential oils[A].Bajaj YPS.Biotechnology in Agriculture and Forestry[C].Berlin,Heidelberg,Springer-Verlag,1994.403～421.

[9]Mathur A K,Ahuja P S,Pandey B,etal.Potential of somaclonal variations in the genetic improvement of aromatic grasses[A].Kukreja A K,Mathur A K,Ahuja P S,etal.Tissue Culture and Biotechnology of Medicinal and Aromatic Plants[C].India,Luc-know,Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants,1989.79～89.

[10]Mucciarelli M,Gallino M,Scannerini S,etal.Callus induction and plant regeneration inVetiveriazizanioides[J].Plant Cell Tiss Org Cult,1993,35:267～271.

[11]George M M,Subramanian R B.High frequency regeneration ofVetiveriazizanioidesvia mesocotyl culture[J].Phytomorphology,1999,49:309～313.

[12]殷丽青，柴晓玲，沈国辉，等．香根草组织培养快速繁殖技术[J]．上海农业学报，2005，21(4)：63～66．

[13]韩露，刘必融，潘超，等．香根草愈伤组织的诱导和快速繁殖[J]．安徽师范大学学报，2004，27(4)：443～445．

[14]Anonymous.Vetiveria[Z].Council of Scientific and Industrial Research,Delhi,1976,Vol.10.

[15]吴齐强，苏海平．环保“宝贝”研究取得重大突破，湛江种子繁殖香根草成功[N]．人民日报，2003-06-11(1)．

[16]刘金祥，李文送，李红燕．种子繁殖香根草植株的生物学特征及其病虫害初报[J]．草业科学，2005，22(4)：108～111．

[17]姚振，朱桂才，刘华．香根草种子繁殖特性研究[J]．长江大学学报(自然科学版)农学卷，2007，4(4)：13～15．

[18]National Research Council.Vetiver grass:a thin green line against erosion[M].Washington,D C:National Academy Press,1993.

[19]姚方印，朱常香，刘理梅，等．提高水稻成熟种胚愈伤组织诱导率及再生率的研究[J]．山东农业科学，2000，(4)：7～9．

[20]张平，左示敏，李爱宏．提高农杆菌转化水稻频率几个因素的研究[J]．中国水稻科学，2004，18(1)：11～15．

2009-11-19

姚振(1980-)，男，湖北荆州人，农学硕士，讲师，研究方向为植物分子生物学与植物学.