邹华文

李翠花，吴启侠

(长江大学农学院，湖北 荆州 434025)

一个玉米逆境响应基因ZmSPK1表达载体的构建及拟南芥转化

李翠花，吴启侠

(长江大学农学院，湖北 荆州 434025)

首次在玉米(ZeamaysL.)中克隆了1个SnRK家族基因，命名为ZmSPK1。为了研究ZmSPK1的功能,把ZmSPK1的cDNA 连接到植物表达载体pGreen0029中，通过农杆菌介导转入拟南芥(Arabidopsis)中进行过量表达。PCR及Western-blot分析表明，ZmSPK1已经转入到拟南芥中，并且在大多数转化植株中稳定表达。

玉米(ZeamaysL.)；SnRK；ZmSPK1；拟南芥(Arabidopsis)

植物中的SnRK1蛋白激酶家族在响应逆境胁迫过程中起到了非常重要的作用。SNF1(sucrose non-fermenting-1)蛋白激酶家族包括酵母中的SNF1，哺乳动物的AMPK(AMP-activated protein kinase)以及高等植物中的SnRK，与CDPK亲缘关系较近，同属于CaMK组。在酵母中SNF1响应细胞内低葡萄糖信号，并且对被葡萄糖抑制的基因的解除抑制作用是必须的，SNF1还可以直接调节许多代谢酶的磷酸化水平[1,2]。AMPK可以在高的AMP/ATP状态下被AMP激活，同时也可以被它的上游蛋白激酶AMP-activated protein kinase kinase (AMPKK)所激活。有资料表明，活化的AMPK可以对哺乳动物细胞对不同逆境条件做出响应[3～5]。近年来的研究发现，高等植物细胞中一些SnRKs序列与酵母和哺乳动物中的SNF1有很高的同源性暗示了它们在功能上的相似性[6]。植物中已经鉴定了3个SnRK亚家族，分别是SnRK1，SnRK2和SnRK3。其中SnRK1与SNF1/AMPK家族具有直接的结构和功能同源性[6]，与SnRK1相比，SnRK2和SnRK3与SNF1/AMPK在序列上的相似程度较低，是植物所特有的，并且可能参与植物对逆境的胁迫反应。

SnRK2是一个相对较小的植物专一性基因家族，最近研究表明它们是受渗透胁迫激活的蛋白激酶。与SnRK1相比,SnRK2亚家族含有一个相对较短的C-端,C-端的一个显著特征是其中含有一个短的酸性 “补丁” 。根据对被克隆成员的遗传距离分析，表明SnRK2可以被分为2组：SnRK2a 和 SnRK2b。其中SnRK2a 组成员的酸性“补丁”中富含氨基酸Asp；而SnRK2 组成员的酸性“补丁”中富含氨基酸Glu[6]。

Kobayashi等[7]和Boudsocq等[8]分别对水稻和拟南芥基因组中的所有SnRK2成员进行了系统的生化研究。Kobayashi等[7]发现水稻基因组中10个SnRK2成员可以对不同的逆境信号作出反应，其中SAPK2、SAPK4、SAPK6和SAPK7都可以受NaCl的诱导表达。体外表达试验发现，所有的10个成员都可以被渗透胁迫激活，但是仅有部分成员被ABA激活。表明不同的激酶成员有其独特的渗透胁迫信号反应方式。Boudsocq等[8]在对拟南芥基因组的10个SnRK2成员的研究中发现，其中9个SnRK2成员可以被甘露醇和NaCl所诱导激活，在这9个成员中又仅有5个可以同时被ABA激活；所有的SnRK2成员都不被冷处理激活。

笔者所在课题组通过同源克隆的方法，从玉米(ZeamaysL.)中克隆了1个全长的cDNA，编码的蛋白与SnRK2b蛋白有很高的同源性。由于这个基因可以受不同的逆境条件诱导，所以把它命名为：ZmSPK1 (for stress-induced protein kinase)(accession number AY722708)。在酵母细胞中表达ZmSPK蛋白，激酶活性分析试验发现，纯化的ZmSPK1蛋白不但具有自我磷酸化功能，而且还可以催化底物磷酸化，说明ZmSPK1编码一个有功能的蛋白激酶。半定量RT-PCR分析表明，ZmSPK1的表达可以被甘露醇、高盐和脱落酸(abscisec acid,ABA)诱导；另外，在不同的组织中，ZmSPK1的表达水平也有很大的差异，在生殖器官中的表达量最高[9,10]。这些结果表明，ZmSPK1可能不但参与了植物对逆境的反应过程，而且在植物的发育过程中起着重要的作用。为了研究ZmSPK1的生物学功能，本课题组构建了植物表达载体，在拟南芥中过量表达ZmSPK1基因，希望从对转基因植株的分析中初步了解其生物学功能。

1 材料与方法

1.1 试验材料

植物材料为拟南芥(Columbia 生态型) ；菌株E.coliDH5α、农杆菌GV3101均由农业部作物营养与施肥重点实验室保存。

DNA 凝胶回收试剂盒购自杭州V-gene 生物技术公司;DNA 限制性内切酶、T4-DNA 连接酶、ExTaq 酶、DNAMarker DL2000+15000购自宝生物大连有限公司(Takara 产品)； anti-HA(3f10) 购自Roche Applied Science(Germany)； peroxidase-conjugated goat anti-rat IgG(H+L) 购自中杉金桥公司；PVDF 膜购自Milipore 公司；其他试剂都是国产分析纯。PCR 引物由北京三博远志生物技术有限公司合成； DNA 测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.2 试验方法

(1)ZmSPK1基因植物表达载体的构建 在pBluescriptKS(+)中间载体上含有pBluescriptKS(+)-ZmSPK1-dHA-His6片段。用BamHⅠ/StuⅠ双酶切上述载体质粒，回收ZmSPK1的cDNA片断，同时笔者所在实验室的带有外源基因的中间载体pUC18-cDNA-dHA也用相同的酶切，去除插入的外源基因，回收载体片断，最后把两个片断连接，构建成pUC18-ZmSPK1-dHA的中间载体。酶切验证与预期结果一致后，用XbaⅠ/EcoRⅠ酶切，得到在35S启动子、C4PPDK增强子控制下的片断：35S -C4PPDK-ZmSPK1-dHA,同时，笔者所在实验室保存的含有相同插入结构(仅插入的外源基因不同)的植物表达载体pGreen0029,也用相同的双酶切，回收载体片断，与上述的插入片断连接，得到在35S启动子和增强子控制的，在pGreen0029载体里表达的ZmSPK1-dHA融合蛋白。连接体系4 ℃反应24 h 后转化E.coliDH5α,转化后挑取阳性克隆提质粒酶切验证,酶切验证正确的菌液送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。以上所用所有载体均由本实验室保存。

(2)ZmSPK1 基因的拟南芥转化 正确连接的质粒用冻融法转化农杆菌GV3101,转化后的农杆菌用花浸蘸法[10]转化拟南芥。

(3)转基因拟南芥的PCR 分子检测 转化拟南芥T0 代的种子经消毒后播在含卡那霉素( 浓度为50 μg/mL) 的MS培养基上进行筛选,挑选在抗性培养基上正常生长的拟南芥植株提取基因组DNA,以DNA为模板,以ZmSPK片断内部的一对特异引物做PCR 鉴定。

(4)转基因拟南芥的Western-blot 检测 取0.3 g经PCR 鉴定呈阳性的拟南芥幼嫩的叶片,加0.5 mL 蛋白提取缓冲液( 配方为：10 mmol/L Tris-HCl,0.02% NaN3,0.001% PMSF,pH8.0) ,液氮研磨后5 000 r/min、4 ℃离心10 min,吸取上清液,即为总蛋白提取液。取适当总蛋白提取液电泳,转膜后以小鼠单克隆抗体ant-HA 为一抗,peroxidase-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) 为二抗进行Western-blot 检测。

2 结果与分析

2.1 ZmSPK1基因植物表达载体的构建

图1 构建好的ZmSPK1植物表达载体示意图Figure 1 Restriction map of ZmSPK1 in plant expression vector pGreen0029

将含有ZmSPK1的片段插入pGreen0029载体相应位置，构建成如图1所示的植物表达载体。连接体系转化大肠杆菌后,挑阳性克隆提质粒,进行酶切验证。结果如图2 所示,所得的酶切片段与期望值完全一致,初步证明已经连接成功。随后，酶切验证正确的质粒进行测序,做进一步验证,测序结果确认了重组质粒的正确性( 测序图未显示)。

2.2 转基因拟南芥的分子鉴定

经过测序确认的载体挑取酶切验证正确的质粒，转化农杆菌GV3101,在抗性培养基上挑取筛选后的GV3101单菌落，提质粒首先进行PCR验证，选取两管扩增出阳性条带的质粒再一次转化大肠杆菌，提质粒，酶切验证正确的GV3101可以用来进行下一步的拟南芥转化。转化后收取T0代拟南芥种子,播在含有50 μg/L卡那霉素的MS培养基上。种子发芽后大多数幼苗子叶变黄,最后死亡,只有少部分幼苗仍然发绿,并且正常的长出真叶,保持正常的生长状态,这部分很有可能就是转化了的幼苗(图3)。

M:DNAmarker;1:重组质粒pGreen0029-ZmSPK1-dHA经Xba/PstⅠ双酶切结果;2:重组质粒pGreen0029-ZmSPK1-dHA经SacⅠ单酶切结果图2 重组质粒pGreen0029-ZmSPK1-dHA的酶切验证Figure2 RestrictionanalysisofrecombinantplasmidspGreen0029-ZmSPK1-dHAfragment图3 拟南芥基因转化T0代种子筛选Figure3 SelectionoftransgenicseedsfromT0generation

在抗性培养基上正常生长的T1代幼苗被转移到土壤中，待植株充分长大，有足够叶子时，取2～3片幼叶，提取总DNA，并以ZmSPK1基因的特异引物进行PCR扩增。结果如图4所示，野生型植株没有扩增出相应条带，同时也发现，抗性筛选的幼苗也有假阳性，例如第6和第9泳道相对应的株系就没有阳性条带。

经PCR初步鉴定的株系，进一步提取总蛋白，用anti-dHA单克隆抗体，通过Western-blot进一步在蛋白水平检测基因的表达。结果如图5所示，多数PCR阳性株系在相应的位置有特异性的印迹条带，当然有的株系和野生型植株一样没有印迹条带，这个结果表明，有些转基因株确实表达了目的基因，同时也有一些发生了基因沉默现象。

M:Marker;1:WT;2:质粒阳性对照;3～11:不同的抗性株系图4 T1代转基因幼苗PCR鉴定Figure4 PCRanalysisofT1transgenicseedlings1:WT;2～6:不同的转基因株系图5 PCR鉴定呈阳性的植株的Western-blot鉴定Figure5 Western-blotanalysisofthedifferentlinesafterPCRanalysis

3 结论与讨论

有研究结果显示，SnRK2b组的许多成员参与了高盐或者高渗透胁迫反应。例如PK-3和SPK-4都可以被脱水和高盐所诱导表达[11]；水稻基因组中10个SnRK2成员都可以对不同的逆境信号作出反应，其中SAPK2、SAPK4、SAPK6和SAPK7可以受NaCl的诱导表达[7]，通过在NCBI中比对，可以发现ZmSPK1与SAPK6氨基酸序列的一致性最高，达到了90%；拟南芥基因组中10个SnRK2成员中的9个成员可以被甘露醇和NaCl所诱导激活[8]，ZmSPK1与其中的SnRK2.4氨基酸序列一致性达到78%，并且ZmSPK1序列也是通过SnRK2.4基因序列作为探针获得的；另外，本研究中RT-PCR实验也表明ZmSPK1的表达受高盐和渗透胁迫的诱导。因此推断本课题组克隆的ZmSPK1参与了植物的抗盐信号途径。为了验证并探明其在抗盐途径中的作用，本研究构建了ZmSPK1的植物表达载体，成功转入模式植物拟南芥中，并且获得了稳定表达的株系，后期的功能验证工作正在进行中。

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2010-03-03

国家自然科学基金项目(30700433)；中国农科院农业资源与农业区划研究所，农业部作物营养与施肥重点实验室开放基金(KFJJ2010-03)

邹华文(1973-)，男，江苏邳州人，理学博士，副教授，研究方向为植物逆境分子生物学.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.02.016

S513;Q789

A

1673-1409(2010)02-S049-04