王文,许栋明,相婕,李蕾,王培昌,艾厚喜,张丽,李林

缺血性脑损伤是危害人类健康的三大疾病之一。我国居民第三次死因调查结果显示,脑血管病已成为我国第1位的死亡原因,死亡率高于欧美国家4～5倍,目前临床上缺少有效的脑保护药。中药治疗脑血管病有确切的临床疗效。我们从中药山茱萸筛选到有效成分莫诺苷,前期细胞试验表明,对神经细胞SY5Y具有抑制过氧化氢损伤、抑制细胞凋亡、钙超载等作用[1-9],有提高局灶性脑缺血再灌注大鼠皮层总抗氧化能力的作用[10]。本试验研究莫诺苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠皮层超氧化物歧化酶及神经细胞数量的影响。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 莫诺苷由本室从山茱萸中提取制备,HPLC分析纯度大于98.5%。维生素E(VE):北京双鹤药业。超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒:南京建成生物工程研究所(批号:20081102)。其他试剂为国产分析纯。

1.2 实验动物分组及给药 72只SPF级Wistar雄性成年大鼠,体重260～280 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,合格证编号:SCXK(京)2007-0001。随机分为假手术组,模型组,莫诺苷小(30 mg/kg)、中(90 mg/kg)、大(270 mg/kg)剂量组和维生素E组(35 mg/kg),每组12只。采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,术后一半动物连续灌胃给药3 d,另一半连续灌胃给药7 d,每天给药1次。

1.3 模型制备 局灶性脑缺血再灌注模型采用改良Zea Longa线栓法[3]制备。大鼠用10%水合氯醛0.35 ml/kg腹腔注射麻醉,仰卧位固定于鼠板上,颈部正中切口,钝性分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉,结扎颈外动脉和颈总动脉的近心端,动脉夹与颈总动脉近心端之间结扎一道缝合线,不扎紧。在颈总动脉接近颈外动脉和颈内动脉分叉处用眼科剪作一斜行细切口,将直径为0.26 mm的尼龙线插入,稍扎紧缝合线,推动尼龙线进入颈内动脉,进入距颈外动脉和颈内动脉分叉处约2 cm时,会有阻挡感,说明栓线已越过大脑中动脉,到达大脑前动脉的起始部。记录栓塞开始时间,结扎颈总动脉上端。缝合肌肉、皮肤。栓塞后2 h,若此时大鼠已苏醒则需要再次将大鼠麻醉,并拔出尼龙线。假手术组的大鼠除不插入尼龙线外,其他操作与手术组相同。

1.4 模型成功及评价标准 参照 Longa及Bederon的5分制评分方法[3-4]对实验动物的神经行为学进行评分。0分:无神经系统损伤症状;1分:不能完全伸展对侧前爪;2分:向左侧转圈;3分:向对侧倾斜;4分:不能自发行走,意识丧失。将0分、1分及4分大鼠剔除并补充各组设计所需大鼠数量。

1.5 SOD测定 脑缺血再灌注后3 d迅速断头取脑,冰生理盐水快速漂洗,彻底去除标本表面血液后,于冰盘上分离患侧脑皮层组织。将大鼠患侧脑皮层组织在电子天平上称重后,用高速电动匀浆器在低温下制成10%组织匀浆液。置低温高速离心机内,12000 r/min离心30 min。SOD检测按照试剂盒说明书进行,并按试剂盒提供的公式进行计算。

1.6 Nissl染色 再灌注7 d大鼠用体积分数为0.04的甲醛行心脏灌注,取脑组织行石蜡包埋。组织切片经脱蜡、逐级乙醇脱水及水洗后,加入缓冲亚甲兰染液10 min,0.2 M乙酸盐缓冲液(pH=4.6)分色2 min。阳性染色者胞核淡染,胞质呈蓝色,即存活的神经元。

2 结果

2.1 SOD 模型组皮层SOD活性降低;与模型组相比,莫诺苷大剂量和VE组SOD活性显著升高(P＜0.01,图 1)。

2.2 脑神经元 模型组神经元数量明显下降;与模型组比较,莫诺苷各组能明显提高神经元数;VE组与模型组无显著性差异(图2)。

3 讨论

缺血性脑血管病具有发病率高、死亡率高、致残率高的特点。寻找有效的预防措施以减少发病率、有效的脑保护措施以减少死亡率以及有效的再生修复措施以减少其致残率和致残程度是研究的关键。

缺血性脑损伤在急性期主要是由于能量障碍引起氧化应急、钙超载、兴奋性氨基酸毒性,造成脑损伤。在这一阶段,抗氧化、抑制钙超载和兴奋性氨基酸毒性是治疗的关键问题。人体抗氧化主要有两种方式,小分子抗氧化物质和抗氧化酶,其中由于氧化应激而诱导产生的抗氧化酶在这个过程中起着重要作用,它是体内抗氧化能力的重要反应。缺血再灌注3 d基本上能够反映药物在急性期抗氧化能力。本研究显示,大剂量莫诺苷和经典的抗氧化剂VE一样,表现出很好的抗氧化活性,显示有良好的应用前景。

脑缺血/再灌注损伤在急性期另外一个病理过程是引起神经元的死亡和凋亡,造成神经元大量减少,造成神经功能障碍。本研究显示,大鼠脑缺血/再灌注后,口服莫诺苷7 d,可以抑制神经元数量的减少,有神经保护作用;而VE没有抑制神经元减少的作用,表明莫诺苷在抑制氧化应激外,另有其他机理产生神经保护作用,值得进一步探讨。

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[10]艾厚喜,李蕾,许栋明,等.莫诺苷对局灶性脑缺血在灌注大鼠皮层总抗氧化能力的影响[J].中国康复理论与实践,2009,15(9):833-834.